【摘要】：大麗輪枝菌是典型的土傳維管束病原真菌,無性繁殖但具有豐富的種群多樣性。根據(jù)其侵染寄主(棉花、秋葵等)的病癥特點,大麗輪枝菌分為落葉和非落葉兩種致病型。落葉型菌株因其對寄主的強致病力和優(yōu)勢適應(yīng)性而在世界范圍內(nèi)廣泛流行;在我國主產(chǎn)棉區(qū),落葉型大麗輪枝菌已成為黃萎病的優(yōu)勢種群,但大麗輪枝菌引起寄主落葉/非落葉性狀分化的遺傳學基礎(chǔ)一直不清楚。本實驗室前期比較基因組學分析發(fā)現(xiàn)棉花高致病型大麗輪枝菌Vd991相對于萵苣和番茄來源的大麗輪枝菌Vd Ls.17和JR2存在一個基因組特異區(qū)段G-LSR2,該片段中7個基因(Vd Df1-Vd Df7,Vd Dfs)通過水平轉(zhuǎn)移從枯萎病菌中獲得,調(diào)控大麗輪枝菌對寄主棉花的優(yōu)勢適應(yīng)性。在此基礎(chǔ)上,通過對來源于我國不同主產(chǎn)棉區(qū)的75株大麗輪枝菌(其中包括59株落葉型菌株、16株非落葉型菌株)群體重測序和基因組比較分析發(fā)現(xiàn),Vd Dfs僅存在于落葉型大麗輪枝菌,在非落葉菌株中完全缺失;7個基因共敲除后,ΔDfs喪失了引起寄主落葉的能力,表明這7個基因具有引起寄主落葉性狀的功能。基因表達分析表明7個基因特異應(yīng)答對棉花的侵染,在侵染早期顯著上調(diào)表達,尤其是Vd Df5和Vd Df6兩個基因在侵染48h被誘導(dǎo)超高表達;利用同源重組獲得了上述7個基因的單基因敲除突變株,落葉表型鑒定顯示只有ΔDf5和ΔDf6缺失突變株喪失了引起棉花落葉表型的能力;回補雙基因Vd Df5_6至ΔDfs突變株和棉花來源的非落葉型大麗輪枝菌VDG78后,轉(zhuǎn)化菌株均能引起棉花落葉表型;以上結(jié)果表明Vd Df5和Vd Df6是調(diào)控落葉表型的關(guān)鍵功能基因。前期遺傳進化分析表明,7個基因從尖孢鐮刀菌中水平轉(zhuǎn)移獲得,序列比對結(jié)果顯示這7個基因雖然與尖孢鐮刀菌中同源基因序列相似性非常高,仍存在顯著的多態(tài)性位點;其中基因Vd Df5存在三個無義突變位點,Vd Df6除了存在18bp的堿基截斷導(dǎo)致編碼序列重新起始外還存在四個無義突變位點;將上述兩個尖孢鐮刀菌中的同源基因異源共回補到非落葉大麗輪枝菌VDG78中未能引起寄主棉花的落葉表型;以上結(jié)果表明Vd Df5和Vd Df6從尖孢鐮刀菌水平轉(zhuǎn)移獲得后經(jīng)歷了選擇進化,從而賦予大麗輪枝菌引起寄主棉花落葉的功能。通過對ΔDfs缺失突變體和野生型菌株Vd991在侵染棉花48h的表達譜分析發(fā)現(xiàn),氧化還原酶基因VEDA_05052受Vd Dfs基因簇顯著調(diào)控;該基因在Vd991侵染棉花早期被誘導(dǎo)超高表達,而在缺失突變株ΔDfs,ΔDf5_6以及非落葉型菌株VDG78的侵染過程基本不表達;該基因編碼乙醇脫氫酶,命名為Vd DH1,落葉功能鑒定顯示Vd DH1過表達至ΔDfs缺失突變體和ΔDf5_6共敲突變體后均能恢復(fù)其落葉表型,表明Vd Dfs基因簇協(xié)同Vd DH1賦予大麗輪枝菌引起寄主落葉功能;缺失突變株ΔDfs,ΔDf5_6和ΔDH1在微氧脅迫條件下的生長表型鑒定結(jié)果顯示,其孢子萌發(fā)和菌絲產(chǎn)孢能力均顯著下降;透射電鏡觀察結(jié)果顯示上述三個突變體穿透棉花皮層進入維管束的能力顯著下降,無法到達維管束;以上實驗表明調(diào)控落葉表型的關(guān)鍵功能基因Vd Df5和Vd Df6及其協(xié)同基因Vd DH1在大麗輪枝菌應(yīng)對寄主維管束的微氧脅迫中發(fā)揮重要作用,促進大麗輪枝菌對寄主棉花維管束微氧脅迫環(huán)境的適應(yīng),最終引起寄主落葉表型。對G-LSR2編碼的22個基因進行功能注釋,其中基因Vd Df5和Vd Df6編碼聚酮合成酶,Vd Df7編碼N-磷脂酰乙醇胺水解磷脂酶D(NAPE-PLD),Vd Df4編碼MFS轉(zhuǎn)運蛋白,呈現(xiàn)典型的次級代謝基因簇特性;突變菌株ΔDfs和其回補菌株EC-Df5_6(ΔDfs)的次級代謝產(chǎn)物處理棉花幼苗結(jié)果顯示,ΔDfs次級代謝組分喪失引起棉花葉片脫落的能力;基因注釋表明,Vd Df7編碼NAPE-PLD,分解NAPE產(chǎn)生NAE;定量分析發(fā)現(xiàn)缺失突變體ΔDfs中NAE12:0含量顯著低于野生型,Vd Df5_6共回補突變體ΔDfs和非落葉型菌株VDG78后可恢復(fù)高水平NAE12:0濃度;大麗輪枝菌群體分析結(jié)果顯示,非落葉型菌株中NAE12:0濃度顯著低于落葉型菌株,在非落葉菌株接種棉花幼苗的基礎(chǔ)上,疊加體外施用NAE12:0,導(dǎo)致棉花落葉表型;過量的NAE12:0導(dǎo)致寄主棉花體內(nèi)FAAHs過量表達,進而引起寄主對脫落酸更加敏感以及體內(nèi)激素失衡最終導(dǎo)致寄主落葉;以上結(jié)果表明,基因簇Vd Dfs通過參與大麗輪枝菌次生代謝物NAE12:0的合成進而影響大麗輪枝菌對寄主落葉性狀的調(diào)節(jié)。綜上所述:基因簇Vd Dfs經(jīng)過選擇進化由鐮刀菌水平轉(zhuǎn)移而來,廣泛存在于落葉型大麗輪枝菌中,該基因簇通過協(xié)同關(guān)鍵乙醇脫氫酶基因Vd DH1在應(yīng)對寄主維管束的微氧脅迫中發(fā)揮重要作用,同時該基因簇通過參與次級化合物NAE12:0的代謝,干擾棉花體內(nèi)FAAHs基因的表達,導(dǎo)致寄主對ABA敏感性增強和體內(nèi)激素水平失衡,最終引起寄主落葉表型。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S432.44
【圖文】：

圖 1.1 棉花黃萎病病害侵染循環(huán)Fig. 1.1 Development and disease cycle of Verticillium dahliae菌致病機理研究進展麗輪枝菌引起的黃萎病研究主要集中在兩個方面：一是圍繞繞寄主的防控技術(shù)研究（Kelly et al., 2009; EI-Bebany et al., 2al., 2012）。其中，針對大麗輪枝菌為害/致病機制已經(jīng)開展了流行學、基因組學與蛋白組學、致病基因與作用機理、病原相關(guān)基因的鑒定及其致病機理研究已經(jīng)成為當前研究的熱點（2009）；菌致病相關(guān)基因的鑒定及其致病機理的研究，現(xiàn)階段主要集壁水解酶類，包括果膠裂解酶、纖維素降解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶白激酶，通過調(diào)控下游細胞壁降解酶的活性，進而參與植物影響大麗輪枝菌對寄主的致病性；（2）分泌蛋白類，主要包（Gao et al., 2010; Michielse et al., 2011; Liu et al., 2013），Vd蛋白，與寄主體內(nèi)的靶蛋白互作，誘導(dǎo)寄主的免疫防衛(wèi)反應(yīng)抗病基因 Ve1，進而調(diào)控寄主的免疫反應(yīng)(Fradin et al., 2009

60℃ 30 sec72℃ 1 min72℃ 10 min12℃ ∞ 實驗結(jié)果1 不同寄主來源的落葉和非落葉大麗輪枝菌性狀分析利用落葉型（D）和非落葉型（ND）遺傳標記對三株不同寄主來源的大麗輪枝菌（Vs.17 和 JR2）進行 PCR 驗證，實驗結(jié)果表明 Vd991 含有落葉型標記而缺失非落葉型標s.17 和 JR2 含有非落葉型標記缺失落葉型標記（圖 2.1A）。進一步對三株不同寄主來枝菌進行落葉表型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高感大麗輪枝菌的軍棉 1 號在接菌 Vd991 大約 4 周葉型表現(xiàn)，而 VdLs.17 和 JR2 呈現(xiàn)出非落葉型表型（圖 2.1B），同時 VdLs.17 和 JR2 殖量與 Vd991 相比相差近百倍（圖 2.1C 和 D），確證大麗輪枝菌的落葉型與 Vd991 束中高繁殖量的優(yōu)勢適應(yīng)性一致，而 VdLs.17 和 JR2 相對 Vd991 缺失譜系特異片段 G-說明可能參與大麗輪枝菌引起寄主的落葉表型。36 cycles

業(yè)科學院碩士學位論文 第二章 大麗輪枝菌落葉性狀遺傳變主適應(yīng)性中發(fā)揮著重要作用（Klosterman et al., 2011; de Jonge et al., 2013）。通過對大麗輪枝菌 Vd991 與大麗輪枝菌 JR2（來源于番茄）和 VdLs.17（來源于萵苣）的較和共線性分析發(fā)現(xiàn)每個基因組均存在多個基因組特異區(qū)段，基因組特異區(qū)段由許因組成（圖 2.2），與番茄大麗輪枝菌 JR2 和萵苣大麗輪枝菌 VdLs.17 基因組比較結(jié)losterman et al., 2011; de Jonge et al., 2013）；其中，棉花大麗輪枝菌 Vd991 存在四個特異區(qū)段（G-LSR1~G-LSR4），4 個片段各自編碼了 32、23、101 和 60 基因�；蛱禺悈^(qū)段編碼的致病相關(guān)基因其可能主要參與大麗輪枝菌的毒力和寄主生態(tài)位的適G-LSR2 主要編碼了 23 基因，其中有 6 個屬于分泌蛋白類、糖苷水解酶類、轉(zhuǎn)錄因。

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本文編號：2787619