【摘要】：【目的】克隆并分析棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)復(fù)眼Clock(Clk)生物鐘基因的c DNA序列,探討棉鈴蟲復(fù)眼中Clk生物鐘基因的晝夜表達模式及其表達水平的影響因子,以確認其在復(fù)眼中是否起著調(diào)節(jié)生物節(jié)律的功能,為理解復(fù)眼中生物鐘基因網(wǎng)絡(luò)提供理論參考�！痉椒ā恳�2日齡棉鈴蟲復(fù)眼為試驗材料,采用RT-PCR和RACE末端擴增技術(shù)克隆棉鈴蟲Clk生物鐘基因。利用生物信息學(xué)軟件對得到的棉鈴蟲CLK氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析。采用實時熒光定量PCR(q RT-PCR)技術(shù),檢測棉鈴蟲成蟲不同器官(頭、胸、腹、足、翅、腦、觸角、復(fù)眼)中Clk生物鐘基因的表達水平;通過設(shè)置不同的光周期環(huán)境,檢測復(fù)眼中Clk生物鐘基因的晝夜表達模式;通過在暗期設(shè)置6 h不同波段光(UV、藍光和綠光)照射,檢測復(fù)眼中Clk生物鐘基因的表達水平;通過設(shè)置棉鈴蟲雌雄蛾交配處理,檢測交配結(jié)束0 h和3 h復(fù)眼中Clk生物鐘基因的表達水平;通過饑餓處理棉鈴蟲雌雄蛾,檢測復(fù)眼中Clk生物鐘基因的表達水平�！窘Y(jié)果】克隆得到棉鈴蟲Clk生物鐘基因的c DNA序列,命名為He CLK(Gen Bank登錄號為KM233158),開放讀碼框1 860 bp,編碼619個氨基酸組成的多肽,理論推測分子量(Mw)為69.32 k D,等電點(p I)為5.71。推導(dǎo)得到的氨基酸序列具有3個跨膜拓撲結(jié)構(gòu),包含多個昆蟲CLK蛋白的保守區(qū)域(PAS和HLH),其與甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和黑脈金斑蝶(Danaus plexippus)的同源性較高,分別為97%和74%。與點蜂緣蝽(Riptortus pedestris)和馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)的同源性較低,分別為53%和52%。q RT-PCR結(jié)果表明在檢測的成蟲器官中,He CLK在復(fù)眼中表達水平最低,觸角中表達水平最高。在14L㑳10D光周期下,復(fù)眼中He CLK的表達量在白天增高,夜晚下降。生物鐘基因的晝夜表達模式在1 d黑暗下可以持續(xù),而在持續(xù)黑暗下固有表達節(jié)律消失。復(fù)眼中He CLK的表達水平在6 h光照后上調(diào),但不同波段光照射無顯著性差異。復(fù)眼中He CLK的表達水平在交配后有下調(diào)趨勢,在雄蛾交配后表達水平顯著性下降。復(fù)眼中He CLK的表達水平在饑餓處理后無顯著性變化。【結(jié)論】成功從夜蛾棉鈴蟲的復(fù)眼中克隆得到Clk生物鐘基因,由Clk生物鐘基因推導(dǎo)得到的氨基酸序列具有典型的CLK蛋白特征,且與昆蟲CLK蛋白同源性較高。在檢測的棉鈴蟲成蟲器官中,He CLK在復(fù)眼中的表達水平最低。He CLK在外周組織復(fù)眼中的表達水平受蛾類自身節(jié)律、光照和蛾類生理狀態(tài)的影響,證實棉鈴蟲復(fù)眼中He CLK在調(diào)節(jié)生物節(jié)律方面具有重要作用,但生物鐘基因網(wǎng)絡(luò)在復(fù)眼與中樞神經(jīng)中是否類似有待進一步深入研究。


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