發(fā)布時間：2020-08-09 14:43

【摘要】：硒的豐缺與人體健康密切相關(guān),硒缺乏或過量都會對機(jī)體產(chǎn)生不利影響。人類飲食中大部分的硒是直接或間接從植物中獲得的,植物可食用部分硒含量的高低直接影響人體膳食的硒攝入水平。在世界范圍內(nèi),缺硒現(xiàn)象十分普遍。茶樹具有較強(qiáng)的富硒能力,是理想的補(bǔ)硒資源。深入研究茶樹對硒的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,對于茶樹硒生物強(qiáng)化和遺傳改良具有重要意義。本研究基于茶樹基因組和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,從中篩選出硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族的多條EST序列,利用RT-PCR克隆獲得了8個茶樹硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的cDNA序列。利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)研究了CsSULTRs在不同硒/硫處理條件下的表達(dá)變化及其在茶樹不同組織的表達(dá)情況,探討了茶樹CsSULTRs對硒的響應(yīng)機(jī)理。并對CsSULTR3.5進(jìn)行了功能初步分析。主要研究結(jié)果如下:1.生物信息學(xué)分析表明,CsSULTRs都含有硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白典型的SLC26A/SulP transporter結(jié)構(gòu)域和STAS結(jié)構(gòu)域。根據(jù)與其他物種SULTR同源性遠(yuǎn)近,將克隆獲得的CsSULTRs分別命名為CsSULTR1.1(GenBank登錄號:KY963791)、CsSULTR1.2(GenBank登錄號:KY963792)、CsSULTR2.1(GenBank登錄號:KY977431)、CsSULTR3.1(GenBank登錄號:KY963793)、CsSULTR3.2(GenBank登錄號:KY977432)、CsSULTR3.3(GenBank登錄號:MF596178)、CsSULTR3.5(GenBank登錄號:MG792805)、CsSULTR4.1(GenBank登錄號:KY963794)。2.qRT-PCR研究結(jié)果表明,茶樹中的CsSULTRs對不同SeO_4~(2-)/SO_4~(2-)處理的響應(yīng)模式不同。其中,根中的CsSULTR1.1受短時缺硫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá),根中的CsSULTR1.2對加硒處理有特異性響應(yīng);而莖中的CsSULTR2.1及第3亞家族的4個成員均受缺硫處理及加硒處理誘導(dǎo);CsSULTR4.1的表達(dá)則不受外界SO_4~(2-)/SeO_4~(2-)供應(yīng)水平的影響。3.組織表達(dá)特異性分析結(jié)果表明,CsSULTRs在茶樹的地上部和地下部、營養(yǎng)器官和生殖器官中均有表達(dá)。其中,在幼齡茶樹中,CsSULTR1.1和CsSULTR1.2主要在根中表達(dá);CsSULTR2.1以及第3亞家族的4個成員均在莖中高表達(dá);CsSULTR4.1主要在莖和葉中表達(dá)。而成年茶樹中,CsSULTR1.2在莖中高表達(dá);CsSULTR2.1在花中的表達(dá)量最高;CsSULTR4.1主要在生殖器官(花和果)中的表達(dá)。此外,研究發(fā)現(xiàn),CsSULTR3.5在各組織的表達(dá)豐度較其他基因高。4.構(gòu)建CsSULTR3.5-GFP融合表達(dá)載體,瞬時轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體,通過激光掃描共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)CsSULTR3.5定位于細(xì)胞質(zhì)膜�？寺～@得CsSULTR3.5基因起始密碼子(ATG)上游2 516 bp的啟動子序列,順式作用元件預(yù)測顯示該區(qū)域存在多種激素響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、脅迫應(yīng)答元件以及結(jié)合位點(diǎn),表明該基因的表達(dá)受多種因素調(diào)控。對不同生長階段的pCsSULTR3.5::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行GUS染色,研究發(fā)現(xiàn),除種子和子葉外,轉(zhuǎn)基因株系各部位都有GUS活性,其中維管組織中的GUS活性最高。CsSULTR3.5過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同硒/硫處理條件下的表型均與野生型擬南芥無顯著差異。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S571.1
【圖文】：

圖 2.1 茶樹硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 CsSULTRs 克隆電泳圖Fig. 2.1 The electrophoresis result of the cloning of the sulfate transporter gene CsSULTRs in tea plantM：DL2000 maker；A：CsSULTR1.1； B：CsSULTR1.2； C：CsSULTR2.1；D：CsSULTR3.1；E：CsSULTR3.2； F：CsSULTR3.3； G：CsSULTR3.5； H：CsSULTR4.12.2.2 CsSULTRs 序列分析表 2.2 茶樹硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸組成和理化性質(zhì)分析Table 2.2 The analysis of amino acid composition and physicochemical properties of all identified CsULTRs genes基因名稱Gene name登錄號Accession No.開放閱讀框ORF（bp）氨基酸Amino Acids理論等電點(diǎn)pI分子量Mw（kDa）CsSULTR1.1 KY963791 1 977 658 8.99 72.58CsSULTR1.2 KY963792 1 977 658 9.04 72.44CsSULTR2.1 KY977431 1 962 653 9.12 71.54CsSULTR3.1 KY963793 1 980 659 7.61 72.39CsSULTR3.2 KY977432 1 953 650 8.79 71.21CsSULTR3.3 MF596178 2 061 686 9.01 74.91

14圖 2.2 CsSULTRs 親/疏水性分析Fig. 2.2 Prediction for hydrophilicity or hydrophobicity of CsULTRsSignalP4.1 Server 信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，克隆獲得的 8 個茶樹硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均無信號都屬于非分泌蛋白。

15圖 2.3 CsSULTRs 信號肽預(yù)測Fig. 2.3 The Signal peptide prediction of CsULTRsTMHMM 跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，CsSULTR1.1、CsSULTR1.2、CsSULTR2.1、CsSULTR3.1、CsSULTR3.2、CsSULTR3.3、CsSULTR3.5、CsSULTR4.1 分別具有 10、10、8、10、12、9、11、12 個跨膜區(qū)（TMs）。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機(jī)制。利用NetPhos 3.1 Server 對 CsSULTRs 的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，第 1 亞家族兩個成員 CsSULTR1.1和 CsSULTR1.2 的磷酸化位點(diǎn)較少，分別為 46 個和 44 個；CsSULTR3.5 的磷酸化位點(diǎn)最多，共有 63 個磷酸化位點(diǎn)（表 2.3）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2787257