【摘要】：馬鈴薯(Solanumtuberosum L.)是全球繼小麥、水稻、玉米之后的第四大糧食作物,由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中最為嚴(yán)重的病害。馬鈴薯進(jìn)化出兩個(gè)分支的免疫反應(yīng)來應(yīng)對(duì)晚疫病原菌的侵染,包括由病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMPs)激發(fā)的 PTI(PAMPs triggered immunity)和由效應(yīng)子(Effector)引起的 ETI(Effecter triggered immunity),激發(fā)一系列抗病反應(yīng)相關(guān)基因來抵抗病原菌的侵染,有時(shí)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)(Hypersensitive response,HR)來抑制病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)展。本實(shí)驗(yàn)室前期克隆到了一個(gè)可能與過敏性反應(yīng)相關(guān)的基因StPOTHR1,該基因受晚疫病原菌、機(jī)械傷害、鹽脅迫和茉莉酸誘導(dǎo)表達(dá),但在馬鈴薯晚疫病抗性上的作用機(jī)制及其與HR的關(guān)系尚不明確。本課題研究了StPOTHR 與HR的關(guān)系、在晚疫病抗病反應(yīng)中的作用機(jī)制及其介導(dǎo)的免疫信號(hào)途徑,為馬鈴薯晚疫病持久抗性育種研究提供了新的思路及潛在的基因資源。主要研究結(jié)果如下:1.獲得了可以高豐度組成型穩(wěn)定表達(dá)GFP且具有與野生型菌株致病力相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因P.infestans菌株W8-G20,為定性和定量研究馬鈴薯與晚疫病原菌互作機(jī)制提供了直觀和簡便的技術(shù)手段;利用W8-G20接種馬鈴薯晚疫病水平抗性基因型386209.10和感病基因型鄂馬鈴薯1號(hào)(E1),能夠清晰的觀察到兩個(gè)基因型表現(xiàn)出明顯不同的發(fā)病癥狀,E1葉片上的熒光強(qiáng)度顯著高于386209.10,386209.10可以顯著地抑制病原菌的增殖速度,說明抑制病原菌在體內(nèi)的定殖和擴(kuò)展可能是水平抗性的一個(gè)重要防御機(jī)制。2.通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)StPOTHR1含有NHL(NDR/HIN1-like)家族的3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,屬于NHL家族成員。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),其與NHL基因家族成員NtHIN1和AtNHL3親緣關(guān)系最近,推測其與植物的過敏性反應(yīng)、抗病性等生物學(xué)過程相關(guān)。原位雜交(ISH)和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明,在垂直抗性基因型鄂馬鈴薯3號(hào)(E3)與晚疫病致病菌株W8互作產(chǎn)生HR的過程中,StPOTHR1只在過敏性病斑部位大量表達(dá),而在其他位置幾乎不能誘導(dǎo)表達(dá),表明StPOTHR1的表達(dá)與HR緊密相關(guān),可能是馬鈴薯抗病反應(yīng)中的起重要作用的基因。3.通過研究StPOTHR1在馬鈴薯對(duì)晚疫病在親和互作(感病)、非親和互作(垂直抗性)以及水平抗性(小種非特異抗性)過程的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)StPOTHR1在垂直抗性基因型E3中能迅速響應(yīng),并維持在較高的表達(dá)水平;而在感病基因型E1中則一直維持在較低的水平,只在后期有上調(diào)表達(dá)的趨勢;在水平抗性基因型386209.10中,表達(dá)水平處于則前兩者之間。研究結(jié)果表明,StPOTHR1基因的表達(dá)量與馬鈴薯的抗性反應(yīng)發(fā)生的強(qiáng)度呈正相關(guān)。4.在感病基因型E1中超量表達(dá)StPOTHR1,能顯著抑制病原菌孢子囊的數(shù)量,顯著提高植株對(duì)晚疫病的抗性,表現(xiàn)出與水平抗性基因型386209.10相似的抗性特征,但在垂直抗性基因型E3中,抑制StPOTHR1的表達(dá)不能抑制HR的產(chǎn)生;同時(shí),在本氏煙草(Nicotianabenthamian)中瞬時(shí)沉默StPOTHR1的同源基因NbPOTHR1后,不會(huì)影響由主效 R/Avr基因(Sto/Ipio、Rvnt-1/Avrvnt-1、Pto/AvrPto、Cf4/Avr4、Cf9/Avr9和R3a/Avr3a)等介導(dǎo)產(chǎn)生的HR,說明StPOTHR1介導(dǎo)的抗性反應(yīng)可能獨(dú)立上述己知的R/Avr介導(dǎo)的HR。5.研究主效 R/Avr 基因?qū)?Sto/Ipio、Rvnt-1/Avrvnt-1、Pto/AvrPto、Cf4/Avr4、Cf9/Avr9和R3a/Avr3a)介導(dǎo)的HR過程中POTHR1的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn),POTHR1只響應(yīng)特異的R/Avr基因?qū)?Pto/AvrPto)介導(dǎo)的HR;同時(shí)其也受到能激活PTI的晚疫病原菌效應(yīng)子INF1和細(xì)菌PAMPs flg22的誘導(dǎo),并且POTHR1也能調(diào)控PTI早期響應(yīng)marker基因的表達(dá),表明POTHR1可能參與了 PTI和ETI的crosstalk。6.在煙草上瞬時(shí)表達(dá)GFP-StPOTHR1融合表達(dá)載體,發(fā)現(xiàn)GFP-StPOTHR1定位于細(xì)胞膜上,通過Western Blot證明了該蛋白的完整性,說明GFP-StPOTHR1的定位能準(zhǔn)確反應(yīng)StPOTHR1在植物體內(nèi)執(zhí)行功能的位置;同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)GFP-StPOTHR1的實(shí)際電泳條帶大于其理論值,其可能是翻譯后修飾所導(dǎo)致,通過利用LC-MS/MS技術(shù),對(duì)StPOTHR1的翻譯后修飾進(jìn)行了探究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)StPOTHR1受到多種翻譯后修飾調(diào)控,GFP-StPOTHR1條帶的遷移可能與這些翻譯后修飾相關(guān)。本研究首次全面地探究了 NHL家族成員StPOTHR1的翻譯后修飾位點(diǎn),對(duì)這些位點(diǎn)潛在功能的探究將進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)植物免疫調(diào)控的認(rèn)識(shí)。7.通過利用IP-LC-MS/MS分析,篩選到一個(gè)植物MAPK級(jí)聯(lián)途徑上的可能與StPOTHR1互作的組分NbMKK5L,進(jìn)一步通過Co-IP確證了 NbMKK5L與StPOTHR1的直接互作,該結(jié)果暗示過表達(dá)StPOTHR1導(dǎo)致的馬鈴薯晚疫病抗性的增強(qiáng)可能與激活植物免疫相關(guān)的MAPK級(jí)聯(lián)途徑相關(guān);本研究構(gòu)建了StPOTHR1基因原核表達(dá)載體并在體外獲得了大量純化活性蛋白,為體外進(jìn)一步直接研究MKK5L與StPOTHR1間的調(diào)控作用,如MKK5L能否直接將StPOTHR1磷酸化等研究提供了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.32
【圖文】：

．．隨著人們對(duì)植物和病原菌互作研究的不斷深入，更多新的理論被提出，最被接受和認(rèn)可的是Ｚｉｇｚａｇ模型假說。Ｚｉｇｚａｇ理論認(rèn)為：病原菌本身具有某些保守，即病原相關(guān)分子模式（Ｐａｔｈｏｇｅｎ邋ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｐａｔｔｅｒｎ，ＰＡＭＰｓ），在長期與病原菌協(xié)同進(jìn)化過程中，植物進(jìn)化出可以識(shí)別這些保守物質(zhì)的受體蛋白，這別反應(yīng)可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)（ＰＴＩ，邋ＰＡＭＰｓ邋ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ邋ｉｍｍｕｎｉｔｙ）邋（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｎｄ邋Ｊａｎｅｗａｙ邋１９９７，邋Ｂｒｕｎｎｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００２，邋Ｊｏｎｅｓ邋ａｎｄ邋Ｄａｎｇｌ邋２００６，邋Ｂｅｎｔ邋ＡＦ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００７）（）；而病原菌進(jìn)化產(chǎn)生的效應(yīng)子（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）能有效地抑制ＰＴＩ（Ｚｉｐｆｅｌ邋２００８，邋Ｄｏｄｄｓ邋ａｎａｔｈｊｅｎ邋２０１０）；接著植物又進(jìn)化出能夠識(shí)別Ｅｆｆｅｃｔｏｒ的受體蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)了邋ＥＴ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ邋ｔｒｉｇｇｅｒ邋ｉｍｍｕｎｉｔｙ），ＥＴＩ抗性強(qiáng)度更劇烈，更能有效阻止病原菌的侵染展，這種級(jí)聯(lián)反應(yīng)使病原菌與宿主植物之間斷相互影響并協(xié)同進(jìn)化（Ｎｉｉｍｂｅｒｇｅｒ邋ｅｌ邋２００４邋）0逡逑

為了更直觀地觀察晚疫病菌對(duì)馬鈴薯的侵染情況，用載體Ｐ３４ＧＦＮ轉(zhuǎn)化Ｐ．逡逑菌株Ｗ８以獲得ＧＦＰ標(biāo)記的病原菌。按２．２．１章節(jié)中的方法獲得并純化了逡逑大量的游動(dòng)孢子（圖３ａ和圖３ｂ），作為受體進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，在抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行篩逡逑選，共得到２５個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子（圖４），分別命名為Ｗ８－ｐ３４ＧＦＮｌ－２５。逡逑ｔ．邐ｂ逡逑．容▲邋＇邐．？國逡逑，邐／－＾＾Ｈ＾＾３３％ｐｅｒｃ0＂逡逑、邐％邋－邋？邐４邐＂■邋？邋．邋ｙ；．邋＂邐Ｐ．邋Ｉｎｆｅｓｔａｎｓ逡逑？耱？＃邐ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ逡逑■邋？邐Ｖ邋？－？邋＂邐Ｐ，邋Ｖ：：邐；｜ｌ３３？Ｐｅｒｃｏｌｌ逡逑＾邋＼０邋邐逡逑圖３晚疫病原菌游動(dòng)孢子誘導(dǎo)、分離與純化逡逑（ａ）誘導(dǎo)釋放游動(dòng)孢子；（ｂ）分離、純化游動(dòng)孢子。逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，邋ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｐ．邋ｉｎｆｅｓｔａｎｓ邋ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ逡逑（ａ）邋Ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ邋ｆｒｏｍ邋ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ；邋（ｂ）邋Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ．逡逑３７逡逑

光蛋白（ＧＦＰ）能否在Ｗ８－Ｇ２０菌株內(nèi)穩(wěn)定遺傳。將繼代培養(yǎng)１０次的菌株Ｗ８－Ｇ２０，逡逑洗脫，熒光顯微鏡鏡檢。結(jié)果顯示，Ｗ８－Ｇ２０菌株的菌絲和孢子囊均釋放較強(qiáng)的綠逡逑色熒光（圖６ａ），說明ＧＦＰ基因在菌株Ｗ８－Ｇ２０內(nèi)可以穩(wěn)定遺傳。逡逑為了驗(yàn)證Ｗ８－Ｇ２０是否具有致病力，將繼代１０次Ｗ８－Ｇ２０菌株和野生型Ｗ８逡逑菌株進(jìn)行活化，在炓麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)２周、洗脫病原菌、誘導(dǎo)產(chǎn)生游動(dòng)孢子后，分逡逑別離體接種馬鈴薯感病基因型鄂馬鈴薯１號(hào)（Ｅ１）的葉片，接種同樣劑量清水的逡逑Ｅ１葉片作為陰性對(duì)照。接種４天后，接種Ｗ８－Ｇ２０的葉片都受到了晚疫病原菌的侵逡逑染，晚疫病菌絲在Ｅ１葉片迅速生長，接種葉片出現(xiàn)了明顯感病的狀態(tài)，與接種野逡逑生型Ｗ８的Ｅ１葉片沒有明顯的區(qū)別，而清水對(duì)照則無感病現(xiàn)象出現(xiàn)（圖６ｂ）；用激逡逑光共聚焦顯微鏡觀察（激發(fā)光波長為４８８邋ｎｍ）熒光標(biāo)記病原菌Ｗ８－Ｇ２０在Ｅ１葉片逡逑上的侵染情況

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本文編號(hào)：2787066