【摘要】：脫水素是一類(lèi)逆境脅迫響應(yīng)蛋白,在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。當(dāng)植物遭受低溫、干旱、高溫和高鹽等非生物脅迫時(shí),可以產(chǎn)生高度親水性蛋白質(zhì),對(duì)細(xì)胞核酸、胞內(nèi)蛋白和膜結(jié)構(gòu)具有特定的保護(hù)作用,對(duì)于穩(wěn)定細(xì)胞膜系統(tǒng)和許多大分子的結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用。脫水素的高表達(dá)可以提高植物的抗逆性。對(duì)研究作物抗逆機(jī)制有重要意義。本文以小麥“鄭引1號(hào)”品種為材料,克隆獲得脫水素WZY2啟動(dòng)子,構(gòu)建脫水素WZY2基因啟動(dòng)子的原核克隆載體(重組菌pAbAi-WZY2)。利用同源重組方法,構(gòu)建酵母誘餌載體(重組菌Y1H-pAbAi-WZY2),對(duì)其進(jìn)行自激活驗(yàn)證,從小麥cDNA文庫(kù)中篩選鑒定與其互作的轉(zhuǎn)錄因子,并對(duì)其特性進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。利用實(shí)時(shí)定量PCR方法,分析了在逆境脅迫下該轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。研究表明,脫水素WZY2基因啟動(dòng)子序列全長(zhǎng)為633 bp(不含ATG),基因啟動(dòng)子含有逆境相關(guān)的順式作用元件,即ABA響應(yīng)元件(ABREs)、厭氧特異性誘導(dǎo)元件(GC-motifs)、低溫響應(yīng)元件(LTREs)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(TGACG motifs);與光響應(yīng)相關(guān)的元件有,AT1 motifs、G-boxes、GATA motifs、TGG motifs。確定酵母誘餌載體的背景表達(dá)水平,從小麥cDNA文庫(kù)中篩選出17個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)反式激活驗(yàn)證,有3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以與啟動(dòng)子WZY2的作用元件互作,分別是bHLH49-like(351)、Zincfinger A20/AN1(407)、bHLH47-like(467)。轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)表明,bHLH49-like(351)基因的CDS序列長(zhǎng)為783 bp,編碼260個(gè)氨基酸,相對(duì)分子量為28.85 ku,理論等電點(diǎn)7.78。AN1-like Zinc finger(407)基因的CDS序列長(zhǎng)為486 bp,編碼161個(gè)氨基酸,相對(duì)分子量為17.74ku,理論等電點(diǎn)8.51。bHLH47-like(467)基因的CDS序列長(zhǎng)為780 bp,編碼259個(gè)氨基酸,相對(duì)分子量為29.15 ku,理論等電點(diǎn)6.62。這些轉(zhuǎn)錄因子均為高度親水蛋白。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,WZY2在不同脅迫下,其表達(dá)量有上調(diào)趨勢(shì)。篩選得到3個(gè)作用于WZY2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子,亦均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),暗示W(wǎng)ZY2表達(dá)可能受到這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,但結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。bHLH49-like(351)、AN1-like Zinc finger(407)、WZY2均響應(yīng)PEG、ABA和低溫脅迫,屬于ABA依賴(lài)型;但bHLH47-like(467)只響應(yīng)低溫脅迫,屬于非ABA依賴(lài)型轉(zhuǎn)錄因子。研究表明,小麥脫水素WZY2基因啟動(dòng)子可以與相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,從而激活下游報(bào)告基因的表達(dá),實(shí)現(xiàn)對(duì)抗逆機(jī)制網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。該研究為小麥耐旱的基因調(diào)控奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2
【圖文】：

載體pAbAi上的報(bào)告基因。當(dāng)獵物蛋白與誘餌菌株結(jié)合時(shí)，GAL4 AD激活A(yù)bAr的表達(dá)，使得細(xì)胞可以在含有AbA抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(如下圖)。圖1.5 酵母單雜交篩選DNA-蛋白互作的原理Fig1.5 Basic principle of screening for protein-DNA interactions with yeast one hybrid如果單雜交系統(tǒng)中內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子可以識(shí)別誘餌序列，將造成很高的本底表達(dá)水平，因此在篩選 cNDA 文庫(kù)前要進(jìn)行嚴(yán)格的自激活性的驗(yàn)證。該體系不僅可以篩選轉(zhuǎn)錄因子，而且在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及基因調(diào)控等方面也有重要作用(王琪等 2008)。目前，單雜交系統(tǒng)有了更為廣泛地應(yīng)用，能夠確定轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的相互作用。以此為前提，對(duì) DNA 結(jié)合蛋白進(jìn)行體內(nèi)體外的驗(yàn)證，并對(duì)其進(jìn)行生理功能方面的研究。在生物合成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平上，有學(xué)者在研究石竹科植物時(shí)發(fā)現(xiàn)，牽牛花(Petunia hybruda)中調(diào)控花青素合成的 AN2 (PhAN2)和 JAF13 (PhJAF13)轉(zhuǎn)錄因子能與菠菜(spinacia oleracea)種子特異表達(dá)的 2 個(gè)基因 DFR (Dihydroflavonol 4-reductase)、ANs(Anthocyanidin synthase)的啟動(dòng)子順式作用區(qū)域發(fā)生相互作用(Shimada et al. 2007)。Ren

第三章 結(jié)果與分析3.1 脫水素 WZY2 基因啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析基于 PlantCARE database，對(duì) WZY2 啟動(dòng)子元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，序列中不僅包本元件，如 TATA-box 和 CAAT-box，與真核生物 RNA 聚合酶 II 識(shí)別和轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)；還含有與逆境相關(guān)的順式作用元件，如 ABRE、LTRE 等 (圖 1)。根據(jù)順式元件的潛在響應(yīng)功能，可將其分為：(1) proWZY2 中與非生物脅迫相關(guān)：ABA 響應(yīng)(ABA-responsive elements, ABREs) 、厭氧特異性誘導(dǎo)元件 (anoxic specific inducelement, GC-motifs)、低溫響應(yīng)元件(low temperature-responsive elements, LTREs)；生物脅迫相關(guān)：生長(zhǎng)素響應(yīng)元件(auxin-responsive elements, TGA elements)、茉莉酸響應(yīng)元件(MeJA-responsive elements, TGACG-motifs)、赤霉素響應(yīng)元件(gibbRespon-sive elements，TATC boxes)；(3) 與光響應(yīng)相關(guān)：AT1 motifs、G-boxes、Gmotifs、TGG motifs；(4) 與種子生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)：胚乳特異性表達(dá)元件(endosperm-sexpression elements，Skn-1motifs)。

CACGTA/tgACACGTGGCA/CACGTC/CAGACGTGGCA參與光CCCCCG 參與缺子元件GTCAT 參與胚TAATA/TATAAAT/TATA/ccTATAAATT核心啟TATCCCA 參與赤TGACG 響應(yīng) MCGTGG體的構(gòu)建增 基因啟動(dòng)子的序列，設(shè)計(jì)引物 Fa PCR 擴(kuò)增，獲得 633 bp (不含 ATp 相吻合，說(shuō)明 PCR 條件合適且成

【參考文獻(xiàn)】

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1 強(qiáng)治全;梁雅s

本文編號(hào)：2786926