【摘要】：NR6A1是核受體亞家族6成員1,其配體未知,屬于孤兒核受體,又稱生殖細胞核因子。已有的研究表明,NR6A1在發(fā)育中的胎盤、神經(jīng)系統(tǒng)、成年人類和動物睪丸、卵巢及大多數(shù)腫瘤組織中均有表達,其功能主要涉及細胞分化、發(fā)育和腫瘤的形成,但其轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的分子機制尚不清楚。本研究首先分別克隆了人及小鼠NR6A1基因啟動子的全長及各截短序列。隨后,分別構(gòu)建了 NR6A1基因啟動子全長及不同截短序列的熒光素酶報告基因表達體系,并分別轉(zhuǎn)染永生化小鼠B型精原細胞GC-1、正常小鼠睪丸Sertoli細胞TM4、人睪丸畸胎瘤細胞NT-2和人胚腎細胞293等細胞系,檢測各啟動子片段的轉(zhuǎn)錄活性。實驗結(jié)果顯示,鼠源Nr6a1基因啟動子的核心區(qū)域位于-169bp～+78bp處;人源NR6A1基因啟動子的核心區(qū)域位于-280 bp～+168 bp處,它們均具有最強的轉(zhuǎn)錄活性。生物信息學(xué)分析顯示,SP1、KLF5、KLF4、CREB1、E2F6和Mafb等6個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點是人、鼠Nr6a1核心啟動子區(qū)共有的,已知SP1、KLF5和KLF4同屬于KLF家族成員,而6個不同轉(zhuǎn)錄因子中有3種是KLF家族因子,同時還發(fā)現(xiàn)兩個啟動子區(qū)都富集SP1結(jié)合位點,提示轉(zhuǎn)錄因子SP1對NR6A1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要作用。進一步利用SP1 ORF表達載體,再結(jié)合熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn),在TM4、GC-1和293細胞系中,NR6A1啟動子區(qū)在SP1的作用下活性均增強,且發(fā)現(xiàn)不同片段的啟動子區(qū)活性與SP1結(jié)合位點的個數(shù)無關(guān),并無疊加效應(yīng)。同時,利用SP1的si-RNA干擾序列,在293和NT-2細胞系中驗證了敲低SP1后,NR6A1啟動子活性下降。這些實驗證實了 SP1對NR6A1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性具有正向調(diào)控作用。此外還發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)靠近起始密碼子的SP1結(jié)合位點發(fā)揮的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用可能比遠端的更強一些。最后,本研究探討了 SP1在NR6A1響應(yīng)氧化損傷過程中的調(diào)控作用。以H2O2為氧化劑,建立了 NT-2細胞氧化損傷模型。用0～70μM的H202處理細胞12h,細胞形態(tài)學(xué)觀察、生化檢測等方法顯示,隨著H202濃度的升高,細胞由圓潤飽滿逐漸變的皺縮扁平,逐漸失去接觸,生長受到抑制,細胞超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活力降低,谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量減少,而脂質(zhì)氧化產(chǎn)物(Malondialdehyde,MDA)的含量上升,說明H202對細胞造成了氧化損傷。在此基礎(chǔ)上,采用定量PCR和Western Blot技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),在H202的作用下,SP1和NR6A1的mRNA和蛋白表達水平均明顯上調(diào)。結(jié)合熒光素酶報告基因?qū)嶒?進一步驗證了 NR6A1基因啟動子區(qū)全長和截短片段的活性在H202作用下顯著增強,提示了在氧化應(yīng)激下NR6A1基因的表達與其啟動子活性密切相關(guān)。當利用si-RNA干擾序列敲低NT-2細胞氧化損傷模型中的SP1基因之后,通過RT-qPCR方法發(fā)現(xiàn)NR6A1基因在mRNA水平的表達也隨之減少,說明SP1參與了 NR6A1基因?qū)202損傷信號的響應(yīng)。綜上,本研究克隆了人及小鼠NR6A1基因啟動子序列,確定了其核心啟動子區(qū)域,證實了 SP1對NR6A1啟動子轉(zhuǎn)錄活性具有正調(diào)控作用,且NR6A1可能通過SP1應(yīng)答氧化損傷信號。這些研究結(jié)果為闡述NR6A1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78
【圖文】：

第１章緒論逡逑１真核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控逡逑在真核生物中，從ＤＮＡ轉(zhuǎn)錄成ＲＮＡ對于啟動基因表達調(diào)控是一個最重要究過程。自從２００６年諾貝爾化學(xué)獎授予Ｒｏｇｅｒ邋Ｄ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇ［１］以表彰他在“真胞轉(zhuǎn)錄分子基礎(chǔ)方面的研宄”以來，最近幾年，科學(xué)家們將其研宄重點放在啟動子區(qū)的順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制方面，這是研究一個的結(jié)構(gòu)及其功能的基礎(chǔ)，也是未來生物學(xué)界研究的熱門話題之一［２］。逡逑真核生物的基因編碼區(qū)是不連續(xù)的，由外顯子和內(nèi)含子間隔排列，上游５＇有啟動子、增強子、沉默子、轉(zhuǎn)錄起始位點等，下游３＇端含有終止子。ＤＮ錄的初產(chǎn)物必須經(jīng)過剪接，去除內(nèi)含子序列；可變剪接是指同一個基因序列，逡逑能會形成不同的成熟ｍＲＮＡ，最終對應(yīng)不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)物（如圖１．１）。逡逑Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邐ｐｏｌｙ－Ａ逡逑

含有啟動子、增強子、沉默子、轉(zhuǎn)錄起始位點等，下游３＇端含有終止子。ＤＮＡ逡逑轉(zhuǎn)錄的初產(chǎn)物必須經(jīng)過剪接，去除內(nèi)含子序列；可變剪接是指同一個基因序列，逡逑可能會形成不同的成熟ｍＲＮＡ，最終對應(yīng)不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)物（如圖１．１）。逡逑Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邐ｐｏｌｙ－Ａ逡逑ｓｔａｒｔ邐Ｔｒａｎｓａｉｐｔｉｏｎ邐、邐ｓｉｔｅ逡逑１邐＊邐Ｉ邋Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｓｔｏｐｓ逡逑＂ＡＴＧ邋ｉｎｌｒｏｎ邋１邋ｉｎｔｒｏｎ邋２邋ｉｎｔｒｏｎ邋３邋ｉｎｔｒｏｎ邋Ａ邐ｉｎｉｒｏｎ５邋ＴＡＡ邋ｔ邋｜邋｜邋＾逡逑ｄ邋ｉｎ邋ｙ，邋ｎ邋■邋ｉ邋ｉ邋＼邐ｎ邋ｎ邐ｆ邐＼邋ｆ邋ｊ邐ｉ邐%煎

本文編號：2785528