【摘要】：叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi,AMF)作為一種專(zhuān)性共生真菌,可與地球上90%的維管束植物形成共生復(fù)合體。研究表明,百脈根作為重要的模式豆科植物,可與AMF形成共生互惠關(guān)系,不僅可增強(qiáng)植株的抗逆性,在農(nóng)林牧上也具有很好的應(yīng)用價(jià)值。大量研究報(bào)道,組蛋白去乙�；�(Histone Deacetylase,HDAC)可影響組蛋白末端氨基殘基上的分子基團(tuán)的修飾,并能調(diào)控下游基因的表達(dá)水平。當(dāng)前,對(duì)此類(lèi)基因的研究是集中在水稻、擬南芥等的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)領(lǐng)域,而對(duì)如何調(diào)節(jié)植物與微生物之間的共生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑鮮有報(bào)道。因此,本研究基于生物信息學(xué)技術(shù),篩選編碼百脈根LjHDAC基因,qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)LjHDT2可被AMF顯著誘導(dǎo)表達(dá),為進(jìn)一步分析該基因敲除后對(duì)AMF共生的影響,本研究利用RNAi技術(shù)建立了LjHDT2-RNAi轉(zhuǎn)基因百脈根,通過(guò)對(duì)AMF侵染效率的分析,初步揭示了該基因在百脈根與AMF共生體系中的作用,主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下所示:1.百脈根的組蛋白去乙�；富蚣易宸治霰砻�,目的基因?yàn)榻M蛋白去乙�；窰D2家族成員。qRT-PCR結(jié)果表明,AMF顯著誘導(dǎo)百脈根根系中的一個(gè)LjHDT基因的表達(dá)水平。序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn),該基因與苜蓿HD2家族的MtHDT2具有非常高的相似性,故將該基因命名為L(zhǎng)jHDT2。2.序列分析表明LjHDT2基因全長(zhǎng)為1156bp,編碼297個(gè)氨基酸,其編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為32.12 kD,等電點(diǎn)為4.88。LjHDT2蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白定位在細(xì)胞核中。3.構(gòu)建了LjHDT2-RNAi干涉重組載體,借助發(fā)根農(nóng)桿菌成功將重組質(zhì)粒導(dǎo)入百脈根植株的根系中,獲得了LjHDT2-RNAi轉(zhuǎn)基因百脈根,定量PCR分析轉(zhuǎn)基因的根系中LjHDT2基因表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)該基因被顯著下調(diào)。4.與AMF互作分析發(fā)現(xiàn),沉默LjHDT2后的轉(zhuǎn)基因百脈根中AMF定殖所需時(shí)間變長(zhǎng),約需20-25天建立穩(wěn)定的共生關(guān)系并產(chǎn)孢;而對(duì)照植株需要15-20天。并且發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因百脈根中AMF定殖率下降,形成孢子的數(shù)目也有顯著的存差異,在侵染15-30天后,AMF的定殖效率是16.67%-33.05%;而在野生型百脈根中是23.50%-44.44%,且其20天時(shí)AMF定殖率與轉(zhuǎn)基因百脈根30天的AMF定殖率無(wú)顯著差異。我們也發(fā)現(xiàn),野生型植株和LjHDT2-RNAi轉(zhuǎn)基因植株根系數(shù)目并無(wú)顯著差異(p0.05)。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q93;Q943.2
【圖文】：

AMF 可與植物進(jìn)行識(shí)別并形成共生復(fù)合體[25-26]，但 AMF 必須依賴(lài)于植物根系胞生的建立，才能從植株內(nèi)獲取營(yíng)養(yǎng)并完成自身的生命周期與下一代的產(chǎn)孢。AMF活史一般有三個(gè)階段[27]：①建立預(yù)共生和共生體階段(孢子的激活、與宿主的識(shí)叢枝形成、對(duì)根系進(jìn)行定殖)；②是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段(菌絲大范圍的分化以及延伸)；生殖生長(zhǎng)階段(無(wú)性生殖并進(jìn)行下一代產(chǎn)孢，完成一個(gè)生活周期)。但是 AMF 是無(wú)性生殖的一種微生物，其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)的分割線(xiàn)并不清晰，通常第二和階段是同時(shí)發(fā)生的。后來(lái) Ike-Izundu 等經(jīng)過(guò)歸納[28]，將這種微生物的生活史分為生階段、預(yù)共生階段和共生階段三個(gè)階段。如圖 1 所示，孢子感應(yīng)到根系的信號(hào)始萌發(fā)，待伸出菌絲后對(duì)對(duì)根系表皮進(jìn)行侵染，菌絲深入細(xì)胞間隙進(jìn)行延伸分化，株中獲取營(yíng)養(yǎng)后在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育形成叢枝結(jié)構(gòu)等，從而完成共生，最后進(jìn)行產(chǎn)進(jìn)行下一輪生活周期。

�；傅幕窘榻B念進(jìn)行去乙酰化修飾的酶即組蛋白去乙�；�(His除去組蛋白末端氨基殘基上的分子基團(tuán)，它對(duì)基因組蛋白(H2A、H2B、H3、H4)是組成核小體的必能夠影響基因水平上的調(diào)控。組蛋白的修飾翻譯去乙�；揎椇�，其結(jié)構(gòu)由于基團(tuán)的變化也發(fā)生類(lèi) 1996 年克隆了史上第一個(gè)去乙�；� HDT1[67]，得到的，緊接著，真菌、雞、大鼠、人，和擬南芥鑒定出來(lái)�，F(xiàn)今主要將 HDAC 分為三大類(lèi)：RPD3綜合近些年關(guān)于此種酶類(lèi)的研究與歸納，并以比酶為主，進(jìn)行植物去乙�；讣易宸治�，結(jié)果如

4 結(jié)果與分析4.1 AMF 與百脈根共生體系的建立4.1.1 G. intraradice 孢子的分離與篩選孢子生長(zhǎng)情況如圖所示(圖 3-1)，從培育 G. intraradice 孢子的 MSR 板子上將 G.intraradice 孢子清洗下來(lái)，進(jìn)行過(guò)濾篩選，最后將孢子懸浮液都收集在容器中，顯微鏡下觀察檢測(cè)。那么從圖 B 中，可以看到孢子本身發(fā)黑，偏瘦小，說(shuō)明該孢子活性不高，且有衰敗跡象，不適合與百脈根共生。而圖 A 中，我們可以發(fā)現(xiàn)，清洗下來(lái)的孢子整體呈豐滿(mǎn)的圓球狀，顏色金黃，而且孢子存在多個(gè)菌絲觸發(fā)點(diǎn)，活性很高，具備與百脈根進(jìn)行共生的先決條件。本實(shí)驗(yàn)以 A 圖中這樣條件的孢子與百脈根進(jìn)行共生。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 盛萍萍;王彬;苑學(xué)霞;王小s

本文編號(hào)：2785739