發(fā)布時間：2020-08-07 05:51

【摘要】：海藻營養(yǎng)豐富,味道鮮美,且在制藥、工業(yè)等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用,因此市場對于海藻的需求不斷增加。這一現(xiàn)象使我國海藻養(yǎng)殖業(yè)正在經(jīng)歷從穩(wěn)步增長到快速增長的轉(zhuǎn)變,養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,養(yǎng)殖技術(shù)也在不斷優(yōu)化更新,養(yǎng)殖品種更加多元化,條斑紫菜(Pyropia yezoensis)、壇紫菜(Pyropia haitanensis)紅毛菜(Bangia)、海帶(Saccharina Japonica)、羊棲菜(Hizikia fusifarme)等。本研究以同屬紅毛菜科紅藻的條斑紫菜和紅毛菜為實驗材料,通過分子克隆和標(biāo)記以及低鹽脅迫的方法,針對隨著海藻養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展而出現(xiàn)的一些問題進(jìn)行了探究,以期為豐富北方海藻種質(zhì)資源和更深入地了解其抗逆性生理生化響應(yīng)提供依據(jù)。實驗結(jié)果表明:以條斑紫菜優(yōu)質(zhì)品系為對照,不同海區(qū)栽培的“黃優(yōu)1號”品系與野生親本在各生化組分(藻膽蛋白、葉綠素a、類胡蘿卜素和可溶性蛋白)含量上有明顯差異。“黃優(yōu)1號”在不同海區(qū)栽培藻體的藻膽蛋白含量均高于其親本“野生群體1”,其中于日照海區(qū)培育的品系1b的各類藻膽蛋白的含量最高,呈顯著性差異(p0.05),而相較于作為同海區(qū)優(yōu)質(zhì)條斑紫菜“對照品系”略低,但差異不顯著(p0.05)。而對于葉綠素a(Chl a)和類胡蘿卜素(Car)含量來說,“黃優(yōu)1號”中來自日照的培育品系1b的各物質(zhì)含量皆顯著高于其親本和其它培育品系以及來自同海區(qū)的優(yōu)質(zhì)條斑紫菜(p0.05)。對于可溶性蛋白(TSPs)來說,雖分為兩個子集,但日照培育的“黃優(yōu)1號”含量仍然最高,但與對照和野生2品系差異不顯著(p0.05)。而同在南通海域栽培的“黃優(yōu)1號”和培育品系2的各物質(zhì)含量相差不大。以上結(jié)果說明,從野生群體中用合適的選育手段培育品質(zhì)更佳的栽培品系(群體)具有可行性。而不同海區(qū)對“黃優(yōu)1號”栽培藻體的品質(zhì)有很大影響,其中于日照進(jìn)行栽培的“黃優(yōu)1號”藻體品質(zhì)最佳。我們推測,來自北方的紫菜種質(zhì)不適于生長在溫度相差較大的南方海域,而日照海區(qū)的環(huán)境條件更適合“黃優(yōu)1號”的生長。為做進(jìn)一步了解,選用rbc L和COⅠ基因特異性擴(kuò)增和AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對“黃優(yōu)1號”條斑紫菜的遺傳多樣性進(jìn)行了探究�；驍U(kuò)增結(jié)果表明,基于rbc L序列(約1200 bp)僅砣磯島養(yǎng)殖繩上全沉水生長的野生紫菜群體與其他品系(群體)具有1.1%的遺傳差異,COⅠ序列(680 bp)也僅南通栽培的兩個品系出現(xiàn)兩個堿基的變異,其他品系(群體)與對照條斑紫菜序列完全一致。而AFLP分子標(biāo)記結(jié)果用7對引物擴(kuò)增出了249條清晰條帶,其有248條為多態(tài)性條帶,多態(tài)性百分比高達(dá)99.6%。遺傳多樣性分析顯示,兩個野生群體Wild 1、2的多態(tài)性最高,分別為47.39%和59.44%;三代“黃優(yōu)1號”及兩個對照組的多態(tài)性均在區(qū)間[20.08%,24.50%]內(nèi)。聚類分析結(jié)果表明,大部分群體間遺傳距離較為相近,多介于[0.0181,0.0758]內(nèi),而同為“黃優(yōu)1號”的嶗山栽培群體HYF2L和對照群體Control2與其它群體間的遺傳距離較遠(yuǎn),多介于[0.1325,0.2527]內(nèi),分析得到各群體間的遺傳距離與養(yǎng)殖方式有關(guān)。由于同為全沉水生活方式的群體間遺傳距離也相隔較遠(yuǎn),我們推測:全沉水生活方式在條斑紫菜遺傳多樣性上起到了關(guān)鍵性的作用。用RACE方法成功克隆了質(zhì)膜H+-ATPase基因PMHA1,5’-RACE與3’-RACE各獲得一條明亮的特異性條帶,長度分別為1000 bp和1800 bp。拼接后,獲得全長為3368 bp的PMHA1基因c DNA,含有一個3129bp長的開放閱讀框,編碼1042個氨基酸,分子量為106.51 k D。綜合其理化性質(zhì)分析,預(yù)測的蛋白共包含29個α螺旋和35個β折疊以及19個蛋白激酶C、1個糖基化位點和3個氨基化位點以及77個磷酸化位點且分布復(fù)雜。我們將紅毛菜的PMHA1蛋白與其他13個物種同源蛋白進(jìn)行了比較分析,結(jié)果顯示物種之間有一定的相似性,但紅毛菜質(zhì)膜H+-ATPase基因的差異較大。綜合上述結(jié)果,我們推測較多的磷酸化位點會讓紅毛菜藻體受到外界脅迫刺激后,該蛋白的活性迅速提高,靈敏度高。其具有P型H+-ATPase家族的特征序列和保守結(jié)構(gòu)域,但未發(fā)現(xiàn)與之匹配度高的同源序列。為了了解PMHA1的表達(dá)特征,應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測該基因在不同程度的低鹽脅迫下的紅毛菜PMHA1基因相對表達(dá)量的變化,得到結(jié)果,該基因在不同程度的低鹽脅迫下,表達(dá)量也明顯發(fā)生改變,出現(xiàn)隨海水占比減少表達(dá)量升高的趨勢,且在同一鹽度脅迫下,表達(dá)量隨脅迫時間增長先升后降。綜合上述結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),為了抵御外界環(huán)境脅迫,紅毛菜藻體中的PMHA1基因表達(dá)量會上調(diào)以維持細(xì)胞內(nèi)外化學(xué)勢梯度,使藻體盡快適應(yīng)脅迫逆境。但超過一定程度,生理響應(yīng)機制會受損,無法繼續(xù)進(jìn)行自我調(diào)節(jié)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖 1-1 性成熟條斑紫菜葉狀體和紅毛菜原葉體a. 放大 400 倍的條斑紫菜雌雄生殖細(xì)胞混生顯微觀；b. 透明條狀紋，即精子囊；c. 紅毛果胞；d. 紅毛菜精子囊）Fig.1-1 Sexual maturity of P. yezoensis leaf thallus and Bangia filamentous thallusa. Mosaic distribution of male and female reproductive cells of P. yezoensis; b. spermatangiumBangia carpogonium; d. Bangia spermatangium）1 紫菜生活史曾呈奎[12]等人在實驗室內(nèi)完成了紫菜的完整生活史循環(huán)。隨著研究的不斷，人們發(fā)現(xiàn)不同種類的紫菜生活史也不盡相同[13]。本文多選用條斑紫菜（Pyrzoensis）為實驗材料，因此這里以條斑紫菜為例介紹生活史。王娟[14]等人將紫生活史分為了四類，而條斑紫菜是典型的異型配子體時代，包括孢子體世代（體）和配子體世代（葉狀體），且同時具有無性生殖和有性生殖兩種生殖方有性生殖中，成熟的紫菜葉狀體的葉緣和葉梢部會形成果胞和精子囊（圖 1-1成熟后，精子囊釋放精子。此時的葉緣會呈現(xiàn)處透明的條狀波紋（圖 1-1b）條斑”二字也因此而得名[14]。受精果胞經(jīng)過細(xì)胞分裂形成果孢子囊，后放散

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文無性生殖相對較簡單，紫菜的葉狀體階段產(chǎn)生并釋放單倍體的無性孢子子，可以萌發(fā)成葉狀體[15、16]。在整個有性生殖過程中，從合子到殼孢子囊階段的染色體皆為二倍體，成生殖細(xì)胞和放散殼孢子時發(fā)生減數(shù)分裂，又變成單倍體。而這種減數(shù)生只在有限的種類中得到了證實，如條斑紫菜[17]。在無性生殖生活史循體倍數(shù)始終不發(fā)生變化。紫菜完整的生活史如圖 1-2[15]所示。

圖 1-3 紅毛菜生活史Fig.1-3 Life history of Bangia類分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀，分子生物技術(shù)快速發(fā)展，且已廣泛應(yīng)用于植物法，利用經(jīng)典遺傳學(xué)研究將生物體的表型與基因量品種[24]。若分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)薄弱，則不利標(biāo)記技術(shù)的研究現(xiàn)狀助育種主要包括，遺傳多樣性分析、雜種優(yōu)勢預(yù)面[26]。其中，遺傳多樣性是生物多樣性的關(guān)鍵所和進(jìn)化的可能性，一定程度上影響著物種的經(jīng)濟(jì)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2783585