【摘要】：研究背景痛風(fēng)是一種常見的尿酸結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)引起的關(guān)節(jié)炎,發(fā)達國家成年人患病率為1%-2%。近幾十年來,隨著飲食和生活方式的變化,我國痛風(fēng)的患病率和發(fā)病率上升迅速。雖然痛風(fēng)的發(fā)病機制尚不清楚,但遺傳易感性被認(rèn)為是一個重要因素。事實上,痛風(fēng)的發(fā)病機制涉及遺傳、環(huán)境和生活方式因素之間復(fù)雜的相互作用。因此,確定一個主要的痛風(fēng)易感基因是邁向分子診斷成功的重要一步,并有助于痛風(fēng)患者靶向治療的發(fā)展。盡管目前痛風(fēng)易感基因研究有了一些進展,識別許多其他未知基因有助于研究尿酸鈉晶體的形成、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及慢性痛風(fēng)石。對大家族進行全基因組連鎖研究及后續(xù)精細(xì)定位是鑒別主效基因的有效方法。課題組前期工作中,選擇一個典型的痛風(fēng)常染色體顯性遺傳家系作為研究對象,在微衛(wèi)星引物D4S1572處獲得最大似然概率值(LOD)值(LOD=1.50),表明該痛風(fēng)家系的致病基因與該位點連鎖,從而初步定位于4號染色體長臂2區(qū)5帶(4q25)。此外臺灣地區(qū)21個家系痛風(fēng)全基因組連鎖分析研究發(fā)現(xiàn),染色體4q25區(qū)微衛(wèi)星標(biāo)記D4S2623與原發(fā)性痛風(fēng)高度連鎖[最大似然概率值(LOD)=4.29]。因此我們推測,染色體4q25區(qū)域某一基因可能在痛風(fēng)發(fā)病中發(fā)揮重要作用。文獻報道炎癥/免疫應(yīng)答和糖脂代謝相關(guān)基因的多態(tài)性位點在痛風(fēng)的發(fā)病機制中起重要作用。染色體4q25區(qū)微衛(wèi)星標(biāo)記D4S1572與微衛(wèi)星標(biāo)記D4S2623之間共包括95個基因,有8個與炎癥/免疫應(yīng)答和糖脂代謝密切相關(guān)的基因未見與原發(fā)性痛風(fēng)相關(guān)性報道。目的本研究分析確定中國漢族男性痛風(fēng)患者中4q25區(qū)域致病基因,揭示新發(fā)現(xiàn)的痛風(fēng)致病基因-表皮生長因子(EGF)在痛風(fēng)炎癥發(fā)病機制中的作用。研究對象和方法研究Ⅰ:1、研究對象第一階段,我們共招募了480例男性痛風(fēng)患者和480例正常男性對照。在第二階段,我們收集1017例痛風(fēng)男性患者和1897例正常對照用于展開精細(xì)定位研究。所有患者和正常對照個體都是無血緣關(guān)系漢族人。痛風(fēng)的診斷根據(jù)1977年美國風(fēng)濕病學(xué)會制訂的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn),排除腎臟疾病、血友病等引起的繼發(fā)性痛風(fēng)。該研究得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準(zhǔn)及符合1975年赫爾辛基宣言,且所有參與者均簽署知情同意書。2、基因分型每個受試者收集2毫升的外周血樣本入已二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝管。使用全血DNA提取試劑盒提取基因組DNA。挑選4q25區(qū)(UCSC表格瀏覽器4q25定義在chr4:107700000-114100000,hgl9基因組序列)候選基因上標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(tag SNP)用于評價候選基因區(qū)段與原發(fā)性痛風(fēng)的相關(guān)性。第一階段基因分型利用Illumina公司GoldenGate芯片技術(shù)及BeadStudio軟件完成。原始基因型數(shù)據(jù)集包含960個樣本和96個單核苷酸多態(tài)性的基因分型信息。按照自動聚類,這些單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點根據(jù)GenTrain評分分類(從0到1)。根據(jù)Illumina公司的指導(dǎo)方針調(diào)整GenTrain評分為0.5分的SNP位點。排除應(yīng)答率低于90%的樣本和SNP位點。第二階段應(yīng)用MassArray系統(tǒng)對EGF和Elovl6基因上的93 tag SNPs進行基因分型。所有的操作流程都依據(jù)該系統(tǒng)的操作說明進行。應(yīng)用15 ng的基因組DNA進行多重聚合酶鏈擴增反應(yīng),并將產(chǎn)物應(yīng)用于位點特異性單堿基延伸反應(yīng)。最終產(chǎn)物進行脫鹽和轉(zhuǎn)移到一個384元素SpectroCHIP陣列。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜完成基因檢測,利用MassARRAY系統(tǒng)Typer軟件完成質(zhì)譜圖分析。隨機抽取的10%的樣本重復(fù)分析進行質(zhì)量控制。3、統(tǒng)計學(xué)分析第一階段、第二階段試驗所有對照人群所有SNP位點都進行哈迪-溫伯格平衡(HWE)檢驗。排除不符合HWE檢驗的SNP位點(P0.001)。病例組和對照組基因型及等位基因頻率計算應(yīng)用X 2檢驗或2 × 3、2 × 2表計算。Cochran-Armitage趨勢檢驗用于分類變數(shù)數(shù)據(jù)分析。因為痛風(fēng)的發(fā)生與年齡、體重指數(shù)相關(guān),因此年齡、體重指數(shù)作為協(xié)變量。應(yīng)用PLINK軟件評價候選基因SNP與痛風(fēng)的相關(guān)性。OR值,95%可信區(qū)間和P值用于檢測不同基因型和疾病的相關(guān)性。第一階段和第二階段所有重要的關(guān)聯(lián)計算使用最大(T)排列程序校正(100000排列)。應(yīng)用Haploview程序進行單倍型重構(gòu)和單倍型為基礎(chǔ)的相關(guān)計算。使用默認(rèn)參數(shù)推斷個體單倍型及其估計的群體頻率,并使用排列程序(100000個排列)對多個測試的P值進行校正。單因素方差分析或者Kruskal-Wallis檢驗進行基因型對各種臨床指標(biāo)的影響。閾值P值設(shè)置為0.05,P0.05被認(rèn)為是有意義的。應(yīng)用Haploview軟件進行連鎖不平衡(LD)分析。方塊應(yīng)用自定義模式:0.7LD0.95表示有連鎖關(guān)系,LD0.9表示強連鎖關(guān)系。排除頻率0.05的SNP標(biāo)記位點。本研究我們應(yīng)用基因功效計算系統(tǒng)(http://pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/gpc/qtlassoc.html)及遺傳模型評估統(tǒng)計學(xué)效力。遺傳模型根據(jù)中國人群中痛風(fēng)的患病率1.14%計算得到22%的風(fēng)險等位基因頻率(約等于本研究中rs2298999次要等位基因頻率)。研究Ⅱ:1、研究對象及實驗方法急性期患者30例,急性痛風(fēng)期診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2015年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)和歐洲風(fēng)濕病聯(lián)合會(EULAR)對痛風(fēng)分類標(biāo)準(zhǔn)建議。慢性期30例,慢性痛風(fēng)診斷依據(jù)痛風(fēng)臨床表現(xiàn)及癥狀。對照組選擇41例健康男性,排除痛風(fēng)及風(fēng)濕免疫性疾病。取受檢者空腹靜脈血5ml,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(EL1SA)檢測血清EGF含量。應(yīng)用不同濃度的單鈉尿酸鹽(MSU)刺激THP-1細(xì)胞系,刺激4h、12h、24 h、48h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清EL1SA檢測EGF濃度;提取細(xì)胞內(nèi)RNA,反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法進行EGF RNA水平的檢測。應(yīng)用100ug/ml MSU刺激THP-1細(xì)胞系24小時后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清EL1SA方法檢測IL-1β的表達量;提取細(xì)胞內(nèi)蛋白,Western blot方法進行pro-IL-1β的含量檢測。細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入不同濃度EGF作用2小時,收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清EL1SA方法檢測IL-1β的含量;提取細(xì)胞內(nèi)蛋白,Western blot方法進行pro-IL-1β的含量檢測。2、統(tǒng)計學(xué)方法所有統(tǒng)計分析均采用SPSS軟件進行,圖形生成使用Prism軟件。多組比較采用單因素方差分析,兩組間的差異采用t檢驗。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果研究Ⅰ:1、候選基因的選擇利用pubmed數(shù)據(jù)庫及人類單體型圖(hapMap)數(shù)據(jù)庫中已有的中國北京和日本東京正常人群基因分型數(shù)據(jù),選擇染色體4q25區(qū)域周圍8個候選基因作為靶基因。其中3個基因與免疫/炎癥代謝通路有關(guān):表皮生長因子(EGF)、淋巴增強子結(jié)合因子1(LEE1)寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體亞基(OSTC)。其余5個基因與糖脂代謝通路有關(guān):細(xì)胞色素P450家族,2家族,U亞家族,多肽1(CYP2U1);超長鏈脂肪酸延伸酶6(ELOVL6)；磷脂酶A2,組12(PLA2G12A);鞘磷脂合酶2(SGMS2);羥�；o酶A脫氫酶(HADH)。2、SNP的選擇及基因分型結(jié)果依據(jù)方法中的SNP挑選原則,第一階段我們在8個候選基因上共挑選了 96個tag SNPs位點。一階段樣本480例男性痛風(fēng)患者和480例正常男性對照基因型數(shù)據(jù)均通過PLINK默認(rèn)閾值。排除應(yīng)答率90%及不符合HWE平衡(PHWE0.001)的SNP位點。96個SNPs位點中,有91個位點通過最初的質(zhì)量控制(QC)的標(biāo)準(zhǔn)。多重校正后,ELOVL6基因上rs12504538 SNP與原發(fā)性痛風(fēng)顯著相關(guān)(Padjusted = 0.00595)。第二階段,擬在Elov16區(qū)域進行精細(xì)定位研究。通過數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),Elov16基因上游為EGF基因,下游為假基因,因此選擇Elov16基因和EGF基因進行進一步研究。應(yīng)用飛行質(zhì)譜法,對Elov16基因及EGF基因上93個標(biāo)記的SNPs進行基因型分析。91個SNPs位點符合標(biāo)準(zhǔn)(應(yīng)答率90%,次要等位基因頻率(MAF)0.05,PHWE0.001)。功效分析顯示,加法模型中,相對危險度1.4-1.6(雜合子和純合子)檢測效力超過80%。EGfrs2298999 T等位基因與中國漢族男性原發(fā)性痛風(fēng)顯著相關(guān)[比值比(OR)=0.77,95%可信區(qū)間(CI)=0.67-0.88,Padjusted=6.42 ×10-3)]。使用Cochran-Armitage趨勢檢驗統(tǒng)計分析顯示類似的結(jié)果。其他SNPs位位點痛風(fēng)組和對照組等位基因頻率分布無統(tǒng)計學(xué)差異。3、連鎖不平衡分析和單倍型關(guān)聯(lián)分析LD分析用于檢測EGF因單倍型與痛風(fēng)的關(guān)聯(lián)性。rs2298999與其他7個SNPs位于一個連鎖格中(rs11569057,rs2237054,rs11569090,rs10857004,rs10010695,rs6533485 and rs11569126)。8個SNPs組成6種高頻率單倍型(H1-H6),對照組中頻率分別為0.281,0.157,0.157,0.12,0.114和0.057。在本研究中,危險單倍型H1(包括rs2298999C等位基因)是頻率最高的單倍型(痛風(fēng)組32.4%,對照組28.1%),H1單倍型與痛風(fēng)顯著相關(guān)(Padjusted= 0.027)。其他的三種單倍型(H2,H4和H5)也包括rs2298999C等位基因,痛風(fēng)組和對照組H2,H4和H5單倍型分布頻率在兩組中分布無差異。4、SNP rs2298999生物信息學(xué)分析UCSC數(shù)據(jù)庫ENCODE數(shù)據(jù)分析顯示,SNP rs2298999和其他11個SNPs位于(組蛋白H3乙酰化賴氨酸27)H3K27ac,H3K27ac是活性增強劑的標(biāo)志物,提示rs2298999位于一個功能區(qū)域。GTex數(shù)據(jù)分析顯示,在所有的表達數(shù)量性狀基因座分析(eQTL)組織中SNP rs2298999均沒有顯著表達數(shù)量性狀位點。5、SNP rs2298999基因型和痛風(fēng)臨床特征相關(guān)性分析EGF基因SNP rs2298999基因型和痛風(fēng)臨床特征相關(guān)性分析顯示:TT基因型痛風(fēng)患者平均病程4.72年,CT基因型痛風(fēng)患者平均病程5.12年,CC基因型痛風(fēng)患者平均病程6.38年。通過Kruskal-Wallis檢驗,SNPrs2298999基因型與痛風(fēng)病程顯著相關(guān)(P=0.023)。研究Ⅱ:應(yīng)用ELISA方法檢測痛風(fēng)患者及對照者血清中EGF水平。與正常對照組相比,痛風(fēng)急性期患者血清EGF濃度明顯降低(20.99±11.80 vs.30.60±11.16,P=0.032)。應(yīng)用不同濃度MSU刺激THP-1細(xì)胞不同時間后,RT-PCR結(jié)果顯示:與空白對照組相比,100ug/ml濃度MSU刺激24小時EGF RNA水平具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。ELISA結(jié)果顯示:100ug/ml濃度MSU刺激24小時與空白對照組相比EGF蛋白水平具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。100ug/ml MSU刺激后24小時后,ELISA結(jié)果顯示IL-1β的表達量明顯增加,Western blot結(jié)果顯示pro-IL-1β的表達量明顯增加。進一步加入EGFlOng/ml,可以顯著減少IL-1β的表達(P0.05)及顯著減少pro-IL-1β的表達。結(jié)論我們發(fā)現(xiàn)了位于4q25區(qū)域的EGF是痛風(fēng)的一個新的易感基因。血清EGF水平與急性痛風(fēng)密切相關(guān)。在MSU介導(dǎo)的痛風(fēng)細(xì)胞模型中,EGF通過抑制IL-1β和pro-IL-1β蛋白水平發(fā)揮抗炎作用。這些發(fā)現(xiàn)增加了目前對痛風(fēng)易感基因的理解,提示EGF可作為治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的潛在治療靶點。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R589.7
【圖文】：

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圖３．邋ｒｓ２２９８９９９上游及下游區(qū)域ＳＮＰｓ連鎖不平衡（ＬＤ）分析．根據(jù)紅色陰影用圖形顯示所有逡逑ｒｓ２２９８９９９上游及下游區(qū)域ＳＮＰｓ邋ＬＤ，白色代表ＬＤ低，暗紅色代表ＬＤ非常高。逡逑ｅｒｒ＊邋＜？２５）邋Ｉ邐ｈＬ＾ＭＨｒ邋：４ｋ邋：７ｆｅ＾邋■？ｉ；；邋ｇＴＦＭＴ￣？期邋￣邋ＴＰＷＰ＾ｆｆＴＷ＊！！逡逑ｓａｌｔ邐５邋Ｍ）／＂邐．邐Ｈ邋ｈ３�。瑰义希铮颍矗哼姡保保福梗埃�，￥ｅ？ｌ邐ｍ，９ｉｄ／￥ｅ？！逡逑ＵＣ￥Ｃ邋Ｇ＾ｆＳ邋Ｐ＾Ｓ？ａ，邋Ｃ？？ｉｆｏｉｒｉｋ．邋ＣＣＣＳ，邐ｔ？Ａｓ邋ｌ邋Ｃｏ？ｏ？＊ａｔ？ｖ＃邋Ｇｅｎａ？？ＣＳ）逡逑｜Ｅ：，：ｚ｜Ｅ＝逡逑ＲｅｆＳ＜邋＼邋Ｃ？ｎ？逡逑Ｒ？ｆ邋￥？０邋0ｒｔ＊Ｓ邐１邐１邐１邐邐邋ｆ邐■邐逡逑Ｍｂｉ邐？Ｔ＃ｄ？ｃｔ；ｏｒｓ邋－邋＊ｒ0ｈｔｗ＊邋Ｅｒｉｊ＃？ｌ邋７？邋－邋ｆ＊ｂ２？！４逡逑Ｃｎｓ？0ｌ邋Ｏｔｎｔｓ邋邐－邐暑邐§邐－｜邐邐邐—邐邐１邐１邐逡逑ｐｙｅｉｔｃａｔｉｏｏｓ：邋Ｓ？ｎ＃ｆｔ？邋ｉ邋ｉｎ邋ｓｃｉ？ｆｉｔ？ｆｉｃ邋ｆｔｒｔｉｃｉＭ逡逑Ｓｗｊｅｎｃｅｓ邐（邐１邐■邐■邐＿■邐邐邐１邐１邐逡逑} 丨邐ＩＩＩ逡逑Ｈｕ？？ｔｎ邋ＢｆｔＮｆｔｓ邋ｆｒｏｍ邋ＣｔｎＲｉｎｋ逡逑ＨＵＭｎ邐邐１邐１邐１邐１邐１邐．邐Ｋ３Ｋ２７ｆｔ＜邋Ｋ？＊ｋ邋（Ｏｆｔｆｎ邋Ｆｏｕｎｏ邋ＮＭｒｆｔｃｔｉｖｆ邋Ｒ？ｓｖ邋ｌｉｉｔｏｒｙ邋Ｅ１？＊＊ｎｔｓ）邋ｏｎ邋７邋ｃ？１１邋ｌｍｗ邋ｆｒｏ＊邋ＣＮＣＯＯＥ逡逑ｊ邋ＭＬ逡逑？邋－邐邐邋＿邐－邐ｌ邋▲邐邐邋丨逢逡逑ｉｔｉｖｔｔｙ邋Ｃｌｕ

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李長貴;陳穎;徐潮;苗志敏;閻勝利;宋懷東;;一個原發(fā)性痛風(fēng)家系致病易感基因染色體定位[J];中華內(nèi)分泌代謝雜志;2007年03期

本文編號：2780075