【摘要】：家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)可引發(fā)家蠶血液型膿病,給蠶業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失。同時(shí),BmNPV也作為良好的外源基因表達(dá)材料應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究和生物技術(shù)等方面。BmNPV同源重復(fù)區(qū)hrs可以作為該病毒基因組復(fù)制的起點(diǎn),并且能夠作為增強(qiáng)子增強(qiáng)基因的表達(dá)效率,對(duì)BmNPV的增殖有著密切的關(guān)聯(lián)。囊膜糖蛋白GP64可識(shí)別細(xì)胞膜表面的受體,是病毒入侵宿主細(xì)胞所需的重要結(jié)構(gòu),對(duì)病毒在宿主體內(nèi)的傳播具有關(guān)鍵性作用。本研究通過(guò)對(duì)采集自廣西各蠶區(qū)的家蠶血液型膿病樣本,進(jìn)行BmNPV多角體的純化,提取其BmNPV病毒株的全基因組,并對(duì)基因組的同源重復(fù)區(qū)hr5和囊膜糖蛋白gp64基因進(jìn)行克隆,經(jīng)過(guò)測(cè)序和序列分析,結(jié)果顯示:1.本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)19株廣西BmNPV病毒株hr5進(jìn)行克隆分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣西BmNPV病毒株的hr5核苷酸序列出現(xiàn)不同程度的變異,表現(xiàn)在由大片段的缺失和插入造成序列長(zhǎng)度差別較大。這種差別不僅出現(xiàn)在不同毒株之間,而且同一毒株兩個(gè)目的序列也不盡相同。19個(gè)供試毒株的hr5大小在165-999 bp之間,其中,有10個(gè)毒株分別擴(kuò)增出兩個(gè)不同長(zhǎng)度的/hr5,有2個(gè)毒株出現(xiàn)了整個(gè)同源重復(fù)序列的缺失,其他毒株也存在不同程度的回文片段缺失或增加。以此認(rèn)定hr5并非病毒復(fù)制的必需因子,但hrs不同的回文序列之間存在功能補(bǔ)償或相互替代作用,使病毒不僅能保持其基因的穩(wěn)定性,更能維持其對(duì)新環(huán)境適應(yīng)性能,這就是病毒在新老環(huán)境下皆能得以為繼與不斷適應(yīng)與生存的意義所在。2.通過(guò)對(duì)供試的18個(gè)BmNPV病毒株gp64基因的克隆。結(jié)果發(fā)現(xiàn),其中有2個(gè)毒株與T3株gp64基因ORF的長(zhǎng)度一致,有2個(gè)毒株的gp64基因ORF在94-96位有3個(gè)核苷酸的缺失,有10個(gè)毒株的gp64基因ORF在97-102位上有6個(gè)核苷酸的插入。該突變位點(diǎn)位于GP64蛋白的N端信號(hào)肽序列,所缺失和插入的氨基酸均為疏水性氨基酸,該突變對(duì)相應(yīng)區(qū)域結(jié)構(gòu)或功能是否有影響還有待進(jìn)一步深入研究。3.依據(jù)與BmNPV病毒株gp64 ORF構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)比較,結(jié)果顯示區(qū)內(nèi)各分離毒株與國(guó)外的毒株不在同一亞群,說(shuō)明gp64基因的遺傳具有地域特點(diǎn)。4.通過(guò)對(duì)供試BmNPV病毒株的gp64基因和hr5序列核苷酸序列同源性對(duì)比,發(fā)現(xiàn)gp64基因序列間的同源性在97.5%以上,而hr5序列的核苷酸同源性僅在66%以上。從此可以認(rèn)定結(jié)構(gòu)蛋白基因gp64更具保守性,而基因間區(qū)序列hr5則不然。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S884.51
【圖文】：

歹丨刪亍邋ＰＣＲ邋擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)，ＧＸＨＪ、ＧＸＪＸ、ＧＸＬＹ、ＧＸＬＣ、ＧＸＮＭ、ＧＸＰＢ、ＧＸＸＤ、逡逑ＧＸＹＦ、ＧＸＹＪ和ＧＸＺＳ出現(xiàn)了兩個(gè)不同長(zhǎng)度的片段，對(duì)兩個(gè)片段進(jìn)行克隆測(cè)序，逡逑它們的核苷酸序列皆符合同源重復(fù)區(qū)的特征。如圖３－３（Ａ）表示ＧＸＴＹ、ＣＸＣＷ、逡逑ＧＸＹＺ１、ＧＸＺＰ、ＧＸＲＸ、ＧＸＭＳ２的擴(kuò)增目的序列大小，圖３－３（Ｂ）表示ＧＸＬＹ逡逑株在擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)兩條目的條帶。逡逑２２逡逑

對(duì)目的條帶進(jìn)行純化后進(jìn)行序列克隆，對(duì)抽提的克隆質(zhì)粒進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增后，逡逑初步鑒定目的條帶成功得到克隆，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，最終確定了陽(yáng)性克逡逑隆，如圖３－４表示ＧＸＬｅＹ－１和ＧＸＬｅＹ－２邋／Ｖ邋Ｉ邋／價(jià)ｍ／／邋Ｉ雙酶切電泳檢測(cè)圖。逡逑２３逡逑

分析ＢｍＮＰＶ病毒株各ＡｒＪ序列同源性，發(fā)現(xiàn)只有ＧＸＺＳ－１和ＧＸＮＮ、逡逑ＧＸＮＭ－１和ＧＸＺＰ、ＧＸＮＭ－２和ＧＸＴＹ之間的同源性達(dá)到了邋１００％，其他序列間逡逑的同源性在５２．５％以上。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2780033