【摘要】：第二部分 胸腺素β4基因修飾內(nèi)皮細胞的體外研究目的:利用腺病毒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)研究Tβ4基因修飾內(nèi)皮細胞的作用。方法:本研究成功將人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)進行培養(yǎng),將Tβ4腺病毒轉(zhuǎn)染細胞,采用不同方法觀察細胞功能。采用常氧和缺氧條件測試細胞凋亡,MTT法檢測細胞增殖;Transwell法測定細胞遷移;Western Blotting法檢測信號通路蛋白表達。結(jié)果:在常氧和缺氧條件下Ad-T β 4組細胞凋亡都減少,尤其Ad-Tβ4缺氧組細胞凋亡率比Ad-NC缺氧組減少更加明顯(12.35%VS 21.24%,p0.05),這種作用能夠被Ly294002阻斷(20.94%);MTT法Ad-T β 4組和對照組和Ad-NC組比較,細胞72小時后增殖率明顯增加(0%VS 3.23%VS 60.04%,P0.05);Transwell法常氧條件下Ad-T β 4組細胞計數(shù)(54.56±3.09)比Ad-NC組(42.11±2.71)和Ad-T β 4+Ly組(14.89±2.80)明顯增多,p:0.01;Western Blotting法在常氧條件下Ad-T β 4組Caspase3相對表達沒有太大變化,而在缺氧條件下Ad-T β 4組Caspase3相對表達較其他組明顯減少。在常氧條件下Ad-T β 4組p-Akt相對表達增加,缺氧條件下Ad-T β 4組p-Akt相對表達也比其他組增加,PI3K抑制劑Ly294002顯著降低了其表達。結(jié)論:腺病毒攜帶T β 4基因可以有效轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞,修飾后的內(nèi)皮細胞更具有生存活力和治療應(yīng)用價值。在缺氧條件下,Tβ4可以提高PI3K表達和酶解活性增加其下游因子Akt的活化。第三部分 攜帶Tβ 4基因腺病毒治療家豬急性心肌梗死的作用研究目的:通過動物實驗研究觀察攜帶T 4基因腺病毒對于急性心肌梗死后缺血損傷的影響。方法:成功建立了 12例家豬急性心肌梗死動物模型,分為三組,Ad-T β 4組、Ad-NC組、對照組,分別經(jīng)冠狀動脈注射Tβ 4腺病毒、NC腺病毒、生理鹽水。造模成功后第2天、第30天,經(jīng)3.0T磁共振檢查心臟功能和梗死面積;梗死部位心肌組織做成組織勻漿,離心后ELISA方法測定T β 4含量。統(tǒng)計學(xué)分析比較。結(jié)果:造模成功后第2天三組的梗死面積占比、EF值都沒有顯著差異。第30天,梗死面積占比(%)在Ad-Tβ4 4組(22.6±3.2)比Ad-NC組(28.0±2.7)和對照組(27.1±1.5)明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);EF值(%)在Ad-Tβ 4組(48.75±3.77)比另兩組增高,與對照組(41.25±2.99)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。Tβ4含量在Ad-Tβ 4組(9.039±2.531ng/ml)明顯比對照組(2.139±0.953ng/ml)和Ad-NC組(2.071±0.797ng/ml)增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:Tβ 4基因腺病毒對急性心肌梗死后的缺血損傷產(chǎn)生有利的影響,并改善了心功能。第四部分 脾功能亢進對心力衰竭患者胸腺素β 4水平的影響目的:觀察脾功能亢進合并心力衰竭患者中氧化應(yīng)激產(chǎn)物和胸腺素β4的水平及內(nèi)皮細胞功能的變化,揭示脾功能亢進惡化心力衰竭的機制。方法:慢性心力衰竭NYHA心功能分級III或IV級的患者,合并脾功能亢進者33例,不合并脾功能亢進者35例。MACS法分離EPCs,PCR定量,TUNEL分析評估細胞凋亡。ELISA方法檢測VCAM-1、ICAM-1、P選擇素、E選擇素、游離血漿血紅蛋白、Tβ 4血清濃度,綠高鐵血紅蛋白檢測游離亞鐵血紅素血清濃度。結(jié)果:游離血漿血紅蛋白(pg/ml)和亞鐵血紅素(pg/ul)在CHF合并脾功能亢進患者中比對照組明顯增加(307.75土130.49 vs.212.46±121.11,P0.001;and 1.96±0.82 vs.1.26±0.77,P0.001,respectively)VCAM-1、ICAM-1、P選擇素和E選擇素表達水平在CHF合并脾功能亢進患者中比對照組更高(p0.001)。24個月后與對照組比較,CHF合并脾功能亢進LVEF明顯降低(41.06%±7.77%vs.47.05%±10.62%,P=0.01),游離血漿血紅蛋白和亞鐵血紅素水平和LVEF有明顯對應(yīng)關(guān)系(r=-0.29,P=0.015;and r=-0.28,P=0.020,respectively)。CHF合并脾功能亢進患者的EPCs顯示有明,顯的增值能力下降(p0.001),缺血刺激6小時后發(fā)現(xiàn)TUNEL+ EPCs(%)比對照組顯著增加(36.5±11.8 vs.21.2±7.4,P0.001)。胸腺素β4水平在CHF合并脾功能亢進組比對照組明顯降低(5.80±3..85 ng/ml vs.8.3.4±4.06 ng/ml,p0.05),通過直線回歸,我們發(fā)現(xiàn)LVEF作為因變量與胸腺素β4水平呈明顯的正直線相關(guān),R=0.331,P=0.006。結(jié)論:脾功能亢進通過激活氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)皮功能障礙惡化了心功能,胸腺素β4在脾功能亢進中減少,并和心功能衰竭程度相關(guān)。第一部分攜帶胸腺素β4基因序列腺病毒載體制備目的:本研究利用全基因合成的質(zhì)粒構(gòu)建腺病毒表達載體,并進行腺病毒的包裝和滴度測定。方法:本實驗采用的是AdMax系統(tǒng)的真核腺病毒包裝體系。先對目的基因序列進行分析檢查,然后根據(jù)基因序列分析結(jié)果,進行設(shè)計合成、酶切、拼接,將合成好的序列裝入pMD-18T載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α,測序并擴增片段,制成含有目的序列的GFP共表達質(zhì)粒,設(shè)計PCR擴增引物擴增后使用Invitrogen公司的重組系統(tǒng)將上述目的片段重組到載體pAD/CMV/V5-DEST上。構(gòu)建的腺病毒表達載體經(jīng)Pac I消化后轉(zhuǎn)染293A細胞,包裝病毒。在病毒滴度檢測方面,本實驗采用了免疫法來檢測腺病毒的滴度。結(jié)果:腺病毒載體重組質(zhì)粒成功制作。確定腺病毒的滴度為2.12×1010ifu/ml。結(jié)論:可以通過全基因合成的途徑成功制備攜帶Tβ4基因序列的腺病毒載體。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R54
【圖文】：

帶有酶切位點的基因全長電泳照片

pIRES-EGFP載體酶切電泳照片

圖 3 帶 attB1 和 attB2 位點的目的基因2. 測序結(jié)果參見“附件：基因測序”：E06_CS100513001_0073.373-1.M13R(D03_CS100525525_5225.Z7730-1.PIRB07_CS100607542_5184.373LR-5.PEGD06_CS100603512_5082.373LR-5.V5RD07_CS100603512_5081.373LR-5.CM階段 2：腺病毒的

【參考文獻】

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本文編號：2779369