發(fā)布時(shí)間：2020-08-02 20:10

【摘要】：Pxa1p為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae過(guò)氧化物酶體上的膜蛋白,與Pxa2p組成二聚體,參與轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入過(guò)氧化物酶體過(guò)程。熱帶假絲酵母能夠發(fā)酵烷烴和脂肪酸生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸,而過(guò)氧化物酶體中發(fā)生的β-氧化會(huì)消耗產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈二元酸造成產(chǎn)率降低。本研究以熱帶假絲酵母Candida tropicalis 1798為宿主菌,通過(guò)基于PCR片段的同源單交換法,快速構(gòu)建ctpxa1基因敲除菌株C.tropicalis 1798-pxa1。利用半定量RT-PCR技術(shù),檢測(cè)ctpxa1基因在C.tropicalis 1798、C.tropicalis 1798-pxa1的表達(dá)量,灰度值比值為2.03,表明ctpxa1在C.tropicalis 1798-pxa1中的表達(dá)被弱化。經(jīng)144 h發(fā)酵,C.tropicalis 1798-pxa1比C.tropicalis 1798的十二碳二元酸產(chǎn)量明顯提升,其產(chǎn)出濃度為10.3 g/L,比野生型菌株C.tropicalis 1798提高了94.3%。
【圖文】：

試劑盒(上生工生物工程股份有公司)膠回收制得的pxa1p1片段與kanr片段，保存于20℃用。1.2.2片段的建以膠回收制得的pxa1p1片段與kanr片段為模，pxa1pF1和kanR1為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增件為：1)95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃火30s，72℃延伸3.5min，5個(gè)循；72℃延伸2min；2)95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃火30s，72℃延伸4.5min，30個(gè)循；72℃延伸10min，4℃保存。擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為2148bp的同源重組片段pxa1p1-kanr，過(guò)程如1所示，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，保存于20℃用。圖1C.tropicalis1798-pxa1工程菌的構(gòu)建流程Fig.1FlowchartofconstructionofC.tropicalis1798-pxa1.

程成等/熱帶假絲酵母ctpxa1基因缺失菌的構(gòu)建及對(duì)長(zhǎng)鏈二元酸積累的影響：010-64807509：cjb@im.ac.cn241鹽酸調(diào)pH至3.0，加Н100mL乙醚，搖瓶至十二碳二元酸完О溶解于乙醚中，靜置30min后取50mL乙醚提取液于100mL燒杯內(nèi)，在通風(fēng)櫥中吹去乙醚，得白色十二碳二元酸。將提取到的二元酸加Н25mL95%中性乙醇溶解，加Н2滴酚酞，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，記消耗的氫氧化鈉積，計(jì)算十二碳二元酸的產(chǎn)量。2結(jié)果與分析2.1氨基酸序列比對(duì)目前關(guān)于酵中pxa1p基因功的研究主要集中在S.cerevisiae和Y.lipolytica中。通過(guò)NCBI分檢S.cerevisiae中Pxa1p(870aa)和Y.lipolytica中YlPxa1p(NCBINo.AJW19428.1，930aa)蛋白的氨基酸序列，并用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果如2所示。分析S�，C.tropicalis中的CtPxa1p長(zhǎng)度為732aa，短于S.cerevisiae和Y.lipolytica中對(duì)應(yīng)的蛋白序列，同時(shí)雖然C.tropicalis中的CtPxa1p序列與S.cerevisiae和Y.lipolytica中對(duì)應(yīng)的蛋白序列都屬于ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，并定于過(guò)氧化物圖2氨基酸序列相似性分析Fig.2Putativeaminoacidsequencealignment.

CR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，獲得大為2200bp左右的帶(4)，與理論值2169bp接近，表明pxa1p1-kanr與pxa1S紊粗刈�，完成ctpxa1基因的。2.4C.tropicalis1798、C.tropicalis1798-pxa1菌株中ctpxa1基因表達(dá)量提取C.tropicalis1798、C.tropicalis1798-pxa1總RNA進(jìn)行定量RT-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如5所示，通過(guò)QuantityOne軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析，ctpxa1基因在C.tropicalis1798、C.tropicalis1798-pxa1灰度值比值為2.03，證明ctpxa1基因在C.tropicalis1798-pxa1的表達(dá)量下。圖3PCR擴(kuò)增目的基因Fig.3PCRamplificationofthetargetgene.(A)PCRproductofhomologyarmspxa1p1gene.M:markerDL5000;1 2:550bpDNAfragmentofpxa1p1genefromC.tropicalis1798.(B)PCRproductofkanrgene.M:markerDL5000;1 2:1600bpDNAfragmentofkanrgenefromplasmidpPIC9K.(C)ProductofoverlapPCR.M:markerDL5000;1 2:2100bpDNAfragmentbyoverlapPCR.

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2779005