【摘要】：核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一種非常重要的植物病原真菌。其寄主廣泛,可以侵染500多種植物,引起菌核病,造成大量的經(jīng)濟(jì)損失。目前主要依靠化學(xué)藥劑防治,但是存在污染環(huán)境、抗性增強(qiáng)等問題。從分子層面研究核盤菌的致病與生長(zhǎng)發(fā)育可以給我們提供新的思路防治核盤菌。研究表明,在核盤菌生活史及侵染循環(huán)中,菌核與子囊盤發(fā)揮重要作用。菌核可以躲過逆境,第二年產(chǎn)生菌絲造成初侵染。子囊盤所產(chǎn)生的子囊孢子再次侵染周邊的植物,造成病害的流行。前期的研究發(fā)現(xiàn)核盤菌中一類具有Forkhead結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子與菌核及子囊盤的發(fā)育有關(guān)。其中一個(gè)Forkhead蛋白Ss-FoxE2的缺失,會(huì)使菌核不能萌發(fā)形成子囊盤。本研究主要利用酵母單雜交技術(shù)篩選與Ss-FoxE2基因互作的蛋白,解析上游調(diào)控子囊盤發(fā)育的途徑。同時(shí)在核盤菌基因組中發(fā)現(xiàn)一個(gè)蛋白Ss-Chk2,該蛋白具有FHA(Forkhead-associated domain)與絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域,并預(yù)測(cè)到其與核盤菌的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。本研究也同時(shí)對(duì)其功能進(jìn)行了分析。通過酵母單雜交的方法從核盤菌c DNA文庫(kù)中篩選出7個(gè)與Ss-FoxE2基因互作的蛋白,編號(hào)SsE2-1~7。構(gòu)建蛋白完整的cDNA序列到pGADT7載體,與誘餌載體共轉(zhuǎn)化酵母初步驗(yàn)證了SsE2-7為假陽性。通過原核表達(dá),成功表達(dá)了除了SsE2-5之外的其他6個(gè)蛋白,且除了SsE2-2外均為可溶性蛋白。用Ni-NTA Agarose純化出了部分蛋白,EMSA實(shí)驗(yàn)證明,以pCold TF為骨架的載體表達(dá)的SsE2-1-2、SsE2-1-3蛋白與探針2、3均發(fā)生了結(jié)合,但不能排除TF蛋白的干擾。采用同源重組的方法,敲除了Ss-Chk2基因。表型分析發(fā)現(xiàn)該基因?qū)η秩窘Y(jié)構(gòu)及致病性影響不大,敲除后菌絲生長(zhǎng)變快,說明該基因在調(diào)節(jié)菌絲生長(zhǎng)方面有一定的作用。對(duì)于不同脅迫條件的,反應(yīng)不同。突變體對(duì)于1 M KCl,1 M NaCl,0.02%SDS更敏感,菌絲比野生型長(zhǎng)的慢。1 M山梨醇處理下突變體與野生型差異不顯著。突變體對(duì)不同濃度的H_2O_2更敏感,突變體在15 m M H_2O_2平板上突變體不能生長(zhǎng),而野生型可以生長(zhǎng)。表明該基因在核盤菌適應(yīng)逆境脅迫中有作用。以上研究結(jié)果,為進(jìn)一步研究Ss-FoxE2調(diào)控子囊盤發(fā)育途徑及Ss-Chk2調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育等奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S432.44

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2778713