【摘要】：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(Reticuloendotheliosis,RE)、馬立克病(Marek's disease,MD)是危害我國養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的兩大重要免疫抑制性疫病。前期對(duì)我省乃至全國范圍內(nèi)雞群RE的檢測,表明RE在雞群的流行越來越普遍,然而,目前尚沒有有效的疫苗對(duì)RE進(jìn)行防控。蘇帥等構(gòu)建了馬立克病毒(Marek's disease virus,MDV)致腫瘤基因meq的缺失疫苗SC9-1,能夠?yàn)槊庖唠u提供100%的免疫保護(hù),顯著高于MD商品化疫苗CVI988/Rispens的免疫保護(hù)(保護(hù)率80-90%)。本研究利用SC9-1構(gòu)建了表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒(Reticuloendotheliosi s virus,REV)env基因的重組MDV,并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了研究。1、構(gòu)建表達(dá)REV env的重組MDV SC9-env,并對(duì)其致病性、免疫保護(hù)效果進(jìn)行了研究以REV SNV株DNA為模板,PCR擴(kuò)增其env基因,克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+);以其為模板,PCR擴(kuò)增整個(gè)REV env基因真核表達(dá)盒與卡那霉素抗性基因分別克隆進(jìn)pUC18載體;pUC18-env-kana為模板,利用含有MDV SC9-1株meq基因位點(diǎn)兩側(cè)同源臂的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增REV env真核表達(dá)盒以及卡那霉素抗性基因,利用同源重組插入SC9-1的meq位點(diǎn),分別篩選出陽性后,最終利用阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)flp重組酶,敲除卡那霉素抗性基因,陽性重組質(zhì)粒命名為SC9-env BAC。選陽性重組質(zhì)粒SC9-env BAC,轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞,拯救重組MDV,利用MDV單抗H19以及REV單抗11B118經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定陽性,命名為SC9-env,分析在CEF細(xì)胞上的復(fù)制水平,利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)SC9-env對(duì)SPF雞的致病性以及SC9-env對(duì)SPF雞感染MDV、REV的免疫保護(hù)效果。SC9-env接種SPF雞沒有引起死亡以及腫瘤的發(fā)生;SC9-env對(duì)感染MDV rMd5的SPF雞能夠提供92%的免疫保護(hù),與SC9-1差異不顯著;SC9-env能夠降低SNV感染SPF雞引起的體重減輕以及滅活苗抗體水平的下降。2、利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)REV env、gp90的不同重組MDV以REV SNV株DNA為模板,PCR擴(kuò)增其env基因、gp90基因,克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pCAGGS;以其為模板,PCR擴(kuò)增整個(gè)REV env基因真核表達(dá)盒、REV gp90基因真核表達(dá)盒并與卡那霉素抗性基因分別克隆進(jìn)pUC18載體。以pUC18-env-kana為模板,利用含有MDV SC9-1株US10基因位點(diǎn)兩側(cè)同源臂的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增REV env真核表達(dá)盒以及卡那霉素抗性基因;以pUC18-gp90-kana為模板,利用含有MDV SC9-1株US10基因位點(diǎn)兩側(cè)同源臂的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增REV gp90真核表達(dá)盒以及卡那霉素抗性基因,利用同源重組插入SC9-1的US10位點(diǎn);以pUC18-gp90-kana為模板,利用含有MDV SC9-1株meq基因位點(diǎn)兩側(cè)同源臂的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增REV gp90真核表達(dá)盒以及卡那霉素抗性基因,利用同源重組插入SC9-1的meq位點(diǎn)。分別篩選出陽性后,最終利用阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)flp重組酶,敲除卡那霉素抗性基因,陽性重組質(zhì)粒命名為SC9-gp90-2 BAC、SC9-env-3 BAC、SC9-gp90-4 BAC;分別提取SC9-gp90-2 BAC、SC9-env-3 BAC、SC9-gp90-4 BAC質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞,拯救三種種重組MDV,利用MDV單抗H19以及REV單抗11B118經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定陽性,命名為SC9-gp90-2、SC9-env-3、SC9-gp90-4。本研究為進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)REV env基因的重組MDV并評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)效果奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明,利用同源重組技術(shù)構(gòu)建的重組MDV SC9-env、SC9-env-3能夠穩(wěn)定表達(dá)REV env蛋白,SC9-gp90-2、SC9-gp90-4能夠穩(wěn)定表達(dá)REV gp90蛋白。重組MDV SC9-env在CEF細(xì)胞上的復(fù)制水平與親本病毒SC9-1相似。3、不同啟動(dòng)子的真核重組質(zhì)粒pcDNA-env、pCAGGS-env、gB-env在CEF細(xì)胞上REV env表達(dá)效果的比較比較帶有不同啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pcDNA-env、pCAGGS-env、gB-env在細(xì)胞上表達(dá)效果。結(jié)果表明β-actin啟動(dòng)子活性強(qiáng)于cmv啟動(dòng)子,而且cmv啟動(dòng)子活性強(qiáng)于gB啟動(dòng)子活性。重組gp90蛋白免疫雞可誘導(dǎo)雞產(chǎn)生特異性抗體,未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng),說明重組亞單位疫苗對(duì)雛雞和種雞是安全可靠的。結(jié)果表明,gp90蛋白具有良好的抗原性,RE亞單位疫苗可以誘導(dǎo)高水平的抗體反應(yīng),對(duì)雛雞和種雞均具有良好的免疫效力。本研究構(gòu)建能夠表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)env基因或gp90基因的重組MDV并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行研究。本研究以前期構(gòu)建的血清I型MDV meq基因缺失株SC9-1為載體,利用同源重組技術(shù)將REV env、gp90基因插入SC9-1的基因組,構(gòu)建重組MDV,SC9-1為載體能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因,構(gòu)建的重組MDV SC9-env對(duì)SPF雞沒有致病性,本研究對(duì)SPF雞感染MDV、REV均具有一定的免疫保護(hù)效果為其它重組MDV的構(gòu)建提供思路,也為REV的免疫防控奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

2014），而對(duì)于REV的防控還沒有更好的方法。另一方面疫苗。隨著MDV毒力的不斷增強(qiáng)，國內(nèi)外學(xué)者正在研究比CVI98疫效果的疫苗（周煜，2014）。同時(shí)利用MDV作為載體的優(yōu)勢，良好免疫效果的MDV重組活載體疫苗。立自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的馬立克基因缺失疫苗，Lee等首次繪制了I型MDV GA株的全基因組圖譜(圖1)，為今后提供了參考依據(jù)。通過比較超強(qiáng)毒Md5與GA株基因組，發(fā)現(xiàn)I型MGA的基因組稍微小于Md5，主要是由于Md5基因組的TRL和IRL區(qū)貝數(shù)的增加以及IRS和TRS區(qū)域長度的增加。I型MDV的基因組中因，meq基因由339個(gè)氨基酸組成，在其N末端含有一個(gè)與jun/fos亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)域，而在C末端富含與WT-1腫瘤抑制基因相域。大量的試驗(yàn)證實(shí)MDV基因組中的meq基因與其致瘤作用密切。

3.1 表達(dá)REV env的重組MDV病毒的構(gòu)建、拯救、鑒定及生物活性比較3.1.1 env的擴(kuò)增與回收利用Env-F/R引物PCR擴(kuò)增1782bp的env基因（圖2），經(jīng)過常規(guī)克隆后測序，測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，可以用來與真核表達(dá)載體連接。圖2目的基因env PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Target gene env PCR amplification electrophoresisM：DL2000 DNA Mark; 1-3：env基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M: DL2000 DNA Mark; 1-3: env gene PCR amplification electrophoresis3.1.2 將env基因、gp90基因與真核表達(dá)載體連接及鑒定上一步驗(yàn)證后的env基因pcDNA3.1載體同時(shí)用限制性內(nèi)切酶HindIII、XbaI酶切后，跑膠驗(yàn)證回收后，用DNA Ligase進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞DH5α后，提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒pcDNA-env（圖3）轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，以REV單抗11B118進(jìn)行IFA鑒定

圖2目的基因env PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Target gene env PCR amplification electrophoresisM：DL2000 DNA Mark; 1-3：env基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M: DL2000 DNA Mark; 1-3: env gene PCR amplification electrophoresis3.1.2 將env基因、gp90基因與真核表達(dá)載體連接及鑒定上一步驗(yàn)證后的env基因pcDNA3.1載體同時(shí)用限制性內(nèi)切酶HindIII、XbaI酶切后跑膠驗(yàn)證回收后，用DNA Ligase進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞DH5α后，提取質(zhì)粒，組質(zhì)粒pcDNA-env（圖3）轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，以REV單抗11B118進(jìn)行IFA鑒定，分別發(fā)亮綠色熒光。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2778858