【摘要】：研究背景苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)是一種由苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)或四氫葉酸(BH4)缺陷所導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳疾病,根據(jù)患者血中苯丙氨酸的濃度是否大于1200umol/L分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型,其中經(jīng)典型PKU患者占該疾病患者總數(shù)的90%,經(jīng)典型PKU主要的臨床表現(xiàn)為高苯丙氨酸血癥,在新生兒階段如果不經(jīng)過有效的苯丙氨酸限制性干預(yù)治療則發(fā)展為認(rèn)知和行為障礙等神經(jīng)系統(tǒng)病變,對(duì)患者的危害十分嚴(yán)重,據(jù)統(tǒng)計(jì),苯丙酮尿癥在我國的發(fā)病率為1:11144,患有苯丙酮尿癥的新生兒需要立即接受低苯丙氨酸的飲食治療,并且該治療至少需要持續(xù)到成年階段,昂貴的治療費(fèi)用對(duì)患者家庭是一個(gè)沉重的負(fù)擔(dān)。根據(jù)該統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),就河南一省每年約有200例PKU患兒出生,該疾病的為按照患者每年平均2萬元的治療費(fèi)用計(jì)算,僅的治療費(fèi)用一項(xiàng)每年就需要4000萬元,此外還會(huì)引發(fā)相關(guān)的社會(huì)問題,該疾病不但嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量,還具有巨大的社會(huì)危害性。因此本研究主要對(duì)經(jīng)典型苯丙酮尿癥患者體內(nèi)PAH基因的突變進(jìn)行相關(guān)的檢測和分析。PAH基因定位于人體12號(hào)染色體,如果夫婦雙方均為突變型基因攜帶者,胎兒則有四分之一的幾率患有該疾病,迄今為止數(shù)據(jù)庫收錄的PAH基因突變已經(jīng)超過了 500種,其中大部分為點(diǎn)突變和缺失突變。PAH基因的突變?cè)谄浠虻母鱾�(gè)位置分布不均,多種熱點(diǎn)突變集中出現(xiàn)在相鄰的幾個(gè)外顯子中。而苯丙酮尿癥的發(fā)病主要由苯丙氨酸羥化酶基因發(fā)生突變進(jìn)而使酶的結(jié)構(gòu)異常所導(dǎo)致,該酶基因結(jié)構(gòu)上的復(fù)雜決性定了其突變位點(diǎn)的多樣性,傳統(tǒng)上對(duì)于苯丙酮尿癥致病基因PAH的檢測方法主要有:PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR-DGGE)、PCR-單鏈構(gòu)態(tài)多相性(PCR-Single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)、高分辨熔解曲線(High resolution melting,HRM)、高效液相色譜分析(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)等,但是隨著基因組學(xué),基因測序技術(shù)的飛速發(fā)展,尤其是大規(guī)模并行測序的普及使基因測序成為檢測苯丙酮尿癥及相關(guān)遺傳疾病基因突變的首選方法。基于此需要建立一組與地域、種群等相關(guān)的具有診斷價(jià)值的突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫,盡管目前可以通過液相雜交捕獲的方法獲取突變基因上成千上萬的突變位點(diǎn),但捕捉芯片價(jià)格昂貴,不適合廣泛的臨床應(yīng)用。因此分析PAH基因突變的情況并加以歸納總結(jié)就顯得尤為重要�；诖吮狙芯糠譃槿齻�(gè)部分:第一部分經(jīng)過文獻(xiàn)檢索收集和數(shù)據(jù)歸納整理,探討全國17個(gè)省PAH基因突變的特點(diǎn);第二部分分析河南省PKU患者PAH基因的突變情況;第三部分通過第二代基因測序技術(shù)檢測對(duì)PKU患者進(jìn)行基因診斷探討其技術(shù)的優(yōu)越性。第一部分全國17省市PAH基因突變情況的調(diào)查分析目的為豐富我國苯丙氨酸羥化酶基因突變數(shù)據(jù)庫,探討全國17個(gè)地區(qū)、不同民族之間苯丙氨酸羥化酶基因突變的特點(diǎn)并加以比較。方法1.文獻(xiàn)檢索按照檢索式:(苯丙酮尿癥or苯丙氨酸羥化酶基因突變)and突變頻率and(外顯子or剪接區(qū))檢索相關(guān)文獻(xiàn)2.文獻(xiàn)甄別篩選檢索到的文獻(xiàn)按照納入排除的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)的甄別篩選納入標(biāo)準(zhǔn):(1)研究內(nèi)容為報(bào)道PAH基因突變;(2)研究例數(shù)在10例以上,收集患者或其家系的標(biāo)本進(jìn)行PAH基因突變的相關(guān)論著性文獻(xiàn);(3)研究方法為常用的基因位點(diǎn)突變研究方法(4)原始文獻(xiàn)有足夠的信息表達(dá)量排除標(biāo)準(zhǔn):(1)研究對(duì)象分組不明確(2)數(shù)據(jù)資料不完整(3)個(gè)案報(bào)道類、綜述類文獻(xiàn)。3.數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用X2檢驗(yàn),以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1全國各地區(qū)苯丙酮尿癥基因突變的研究狀況37篇全國范圍內(nèi)針對(duì)苯丙酮尿癥患者PAH基因相關(guān)突變位點(diǎn)的研究,文獻(xiàn)研究覆蓋全國17個(gè)省、自治區(qū)、直轄市全部研究時(shí)間范圍為1994年-2017年,包含PAH基因外顯子1、2、3、4、5、6、7、10、11、12及其兩側(cè)的剪接區(qū)位點(diǎn)。研究樣本總例數(shù)1455例,所有文獻(xiàn)共檢出突變位點(diǎn)2929個(gè)。2全國范圍內(nèi)苯丙酮尿癥患者PAH基因突變情況根據(jù)已收集到的調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果,PAH基因的熱點(diǎn)突變有14個(gè),其中錯(cuò)義突變7個(gè),無義突變4個(gè),剪接突變、沉默突變、缺失突變各1個(gè)。熱點(diǎn)突變頻率在2%以上的突變位點(diǎn)有6個(gè),分別為:R243Q、Y204C、Y356X、R111X、V399V、R413P 其余熱點(diǎn)突變分別為:R241C、IVS4-1GA、S70del、A434D、R53H、W326X、Y166X、R408W。3全國苯丙酮尿癥患者PAH基因熱點(diǎn)突變分布情況R243Q、Y204C、Y356X、R111X、V399V、R413P 6 個(gè)高頻熱點(diǎn)突變頻率在全國北方、南方、西部地區(qū)的分布有所差異其中R243Q、V399V和R413P在中國北方、南方、西部地區(qū)的突變頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4漢族、回族、維吾爾族苯丙酮尿癥患者PAH基因熱點(diǎn)突變情況R243Q、Y204C、Y356X、R111X、V399V、R413P 6 個(gè)高頻熱點(diǎn)突變頻率在全國漢族、回族和維吾爾族人群中的分布差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論R243Q是中國人群中PAH基因的最主要突變位點(diǎn),此外Y204C,Y356X,R111X,V399V,R413P的突變?cè)谖覈巳褐蟹植紡V泛,但是具有一定的地域差異性和民族差異性。第二部分 河南省PKU患者PAH基因的突變情況研究目的本研究旨在探索河南省人群經(jīng)典型PKU患者PAH基因突變的情況,為該地區(qū)民族建立PAH基因突變數(shù)據(jù)庫,為其遺傳咨詢,產(chǎn)前診斷提供重要的參考數(shù)據(jù)。方法本研究根據(jù)人民衛(wèi)生出版社出版的第八版《醫(yī)學(xué)遺傳病學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)以2015年1月-2016年1月來自鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院遺傳咨詢門診、鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院河南省新生兒篩查中心進(jìn)行基因診斷的25例苯丙酮尿癥家系為研究對(duì)象1.應(yīng)用人外周血基因組DNA快速提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取。2.應(yīng)用用PCR方法通過引物對(duì)的PAH基因13對(duì)外顯子引物進(jìn)行突變位點(diǎn)的捕獲和擴(kuò)增。3.應(yīng)用Sanger測序法對(duì)捕獲的PAH基因13對(duì)外顯子DNA進(jìn)行測序4.統(tǒng)計(jì)方法見第一部分。結(jié)果1河南省PKU患者的新型突變檢測到發(fā)生在第3外顯子上的c.251AG的新型基因突變。2苯丙酮尿癥患兒PAH基因突變位點(diǎn)的檢出情況在50條染色體中共檢測到28種,53個(gè)基因突變,突變檢出率為92%。25例患兒中有2例未檢測到突變位點(diǎn),7例患兒檢測到3個(gè)位點(diǎn)突變,11例患兒檢測到2個(gè)位點(diǎn)突變,5例患兒檢測到1個(gè)位點(diǎn)突變。3苯丙酮尿癥患兒PAH基因突變位點(diǎn)的突變頻率的分布情況53個(gè)突變位點(diǎn)分布于PAH基因第3、6、7、11、12、13外顯子以及第4、5、6、12內(nèi)含子區(qū)域(見表8);發(fā)生突變頻率最高的區(qū)域是第6、7外顯子區(qū)域,占總體突變的53.7%,其中突變頻率最高的位點(diǎn)為c.1238GC(p.R413P),突變頻率為 17.0%、其次為 c.617AG(p.Y206C)和 c.728GA(p.R243Q)分別占總突變頻率的7.5%。結(jié)論1.本研究首次發(fā)現(xiàn)PKU患者PAH基因第3外顯子上251位點(diǎn)堿基AG的突變,即c.251AG(p.D84G)的新型突變;2.以下三種突變 c.1238GC(p.R413P)、c.617AG(p.Y206C)和c.728GA(p.R243Q)是本省PKU患者PAH基因突變的熱點(diǎn)突變第三部分 利用第二代基因測序檢測苯丙酮尿癥患者PAH基因突變目的本研究擬利用第二代基因測序技術(shù)對(duì)苯丙酮尿癥患者做出基因診斷,將二代測序在檢測苯丙酮尿癥患者PAH基因突變位點(diǎn)的準(zhǔn)確性同一代測序進(jìn)行對(duì)比,為建立該疾病的第二代基因測序技術(shù)診斷平臺(tái)的建立提供數(shù)據(jù)支持。方法本研究根據(jù)人民衛(wèi)生出版社出版的第八版《遺傳病學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)象為2014年1月至2016年1月到鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的25個(gè)計(jì)劃接受基因診斷的苯丙酮尿癥患者為研究對(duì)象。1.應(yīng)用人外周血基因組DNA快速提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取。2.應(yīng)用用多重PCR方法通過設(shè)計(jì)的PCR長引物對(duì)PAH基因進(jìn)行全外顯子捕獲和擴(kuò)增。3.應(yīng)用第二代基因測序平臺(tái)對(duì)捕獲的PAH基因13對(duì)外顯子DNA進(jìn)行測序4.統(tǒng)計(jì)分析方法同第一部分結(jié)果1測序文庫的構(gòu)建情況長引物PCR捕獲方法的文庫構(gòu)建成功、文庫片段基本分布在200bp左右達(dá)到序列分析標(biāo)準(zhǔn)2第二代基因測序技術(shù)對(duì)PKU患者PAH基因突變的檢出情況通過第二代基因測序?qū)Υ_診的25例苯丙酮尿癥患兒檢測中,對(duì)其PAH基因13個(gè)外顯子和其雙側(cè)剪接區(qū)進(jìn)行測序分析結(jié)果顯示在50條染色體中共檢測到29種,54個(gè)基因突變,25例患兒中有1例未檢測到突變位點(diǎn),突變檢出率達(dá)到了 96%。被檢出樣本中7例檢測到3個(gè)位點(diǎn)突變,11例檢測到2個(gè)位點(diǎn)突變,5例檢測到1個(gè)位點(diǎn)突變。同一代測序進(jìn)行結(jié)果準(zhǔn)確性對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論第二代基因測序技術(shù)同一代測序技術(shù)相比在分析苯丙酮尿癥患者PAH基因突變方法測序速度更快,結(jié)果可靠,成本低廉、適合進(jìn)行大樣本量大范圍的突變位點(diǎn)的測序檢測。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R725.8
【圖文】：

圖１．ＰＡＨ基因各外顯子ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖逡逑２．４邋Ｓａｎｇｅｒ上機(jī)測序逡逑本研宄使用邋ＡＢＩ邋ＰＲＩＳＭ？邋ＢｉｇＤｙｅ？邋Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ邋ｖ３＿ｌ邋ｃｙｃｌｅ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋Ｋｉｔ邋測逡逑ＰＣＲ。逡逑

Ｒ４１３Ｐ、Ｒ１１１Ｘ、ＩＶＳ４－１Ｇ＞Ａ邋和邋Ｒ２４１Ｃ，其次為邋Ｓ７０ｄｅｌ、Ａ４３４Ｄ，突變分布在邋ＰＡＨ逡逑基因。其中Ｅｘｏｎ邋７及兩側(cè)的內(nèi)含子所含的突變最多，其次為Ｅｘｏｎ邋１１、Ｅｘｏｎ邋１２、逡逑Ｅｘｏｎ邋６、Ｅｘｏｎ邋３和Ｅｘｏｎ邋５邋（圖２）因此對(duì)于該基因熱點(diǎn)突變的研究及其重要，逡逑目前對(duì)基因疾病診斷最直接的方法就是進(jìn)行目的位點(diǎn)的基因測序，測序技術(shù)的逡逑發(fā)展突飛猛進(jìn)，第二代基因測序技術(shù)已經(jīng)為臨床上對(duì)基因疾病的診斷做出了重逡逑要的貢獻(xiàn)，因此本研究擬利用第二代基因測序技術(shù)對(duì)苯丙酮尿癥患者做出基因逡逑診斷，初步建立利用第二代基因測序技術(shù)診斷該疾病的診斷平臺(tái)。逡逑Ｋ＼0ｎ２．（＞．邋１％逡逑Ｋ＼ｕｎＫ．邋｜？／．邐２．邋Ｉ％邐２．逡逑＼邋／，％逡逑Ｊ：＼ｏｎｌＯ．邋｜７．３Ｖ0邐、逡逑２ｋ逡逑ｅｘｏｎＪ．４８．１０％邐Ｅｘｏｎ７．１９７．３９％邐■邋Ｋ＼ｉ＿逡逑■邐Ｋ＼＂ｎＪ逡逑■邐Ｅ＼ｏｎ５逡逑Ｉ＼0ｎｌ0逡逑￡？＞0？，邋５０．１０％邐＾逡逑Ｆ．＆ｏｎｌ２．邋ｂｌ．邋１２％逡逑▲”

３．２第二代基因測序序列片段分布逡逑二代基因測序結(jié)果采用可視化軟件在服務(wù)器直接比對(duì)，通過下載數(shù)據(jù)可視逡逑化圖形分析顯示，圖３中測序文庫片段主要分布于２００ｂｐ左右，測序文庫建立逡逑良好。逡逑Ｒｅａｄ邋Ｌｅｎｇｔｈ邋Ｈｉｓｔｏｇｒａｍ逡逑１００００邋１１邋１逡逑８０００邋？邐ｍ逡逑ｍ逡逑■逡逑；６０００邋？逡逑Ｓ逡逑４０００邐’邋：邋■邋｜逡逑２０００邋■邋１邋卜．：＊邋４邋＇逡逑：、．—一逡逑５０邋＂邋１００邐１５０邐２００邋—邋２５０逡逑Ｒｅａｄ邋ｌｅｎｇｔｈ逡逑圖３．第二代基因測序序列片段分布逡逑３．３邋２５例苯丙酮尿癥患者ＰＡＨ基因突變位點(diǎn)兩種測序方法結(jié)果比較逡逑采用第二代基因測序法對(duì)確診的２５例苯丙酮尿癥患兒中，對(duì)其ＰＡＨ基因逡逑１３個(gè)外顯子和其雙側(cè)剪接區(qū)進(jìn)行測序分析結(jié)果顯示在５０條染色體中共檢測到逡逑２９種，５４個(gè)基因突變，２５例患兒中有１例未檢測到突變位點(diǎn)，突變檢出率達(dá)逡逑到了邋９６％。被檢出樣本中７例檢測到３個(gè)位點(diǎn)突變，１１例檢測到２個(gè)位點(diǎn)突變，逡逑５例檢測到１個(gè)位點(diǎn)突變，同一代測序結(jié)果基本一致（表１３）。兩種檢測方法逡逑經(jīng)過對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表１４）。逡逑５６逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2774378