【摘要】：研究背景與目的TNNI3K是一種具有絲裂酶原蛋白激酶活性的心肌特異性激酶,因與cTnI相互作用而得名。近十幾年來研究發(fā)現,一方面,TNNI3K可能參與了心臟向心性肥厚、PR間期延長及加速擴張性心肌病的進展等病理過程；另一方面,TNNI3K在減少缺血性心室重構,增強心肌功能,誘導心肌細胞分化以及增加心肌細胞數量等方面發(fā)揮心臟保護作用。染色體定位分析提示TNNI3K基因位于1號染色體短臂3區(qū)1帶(1p31.1-p31.2)。該區(qū)域恰與心臟房室間隔缺損易患基因所在區(qū)域鄰近。我們推測TNNI3K可能參與了心臟發(fā)育過程的某個階段及心肌細胞分化過程。因此,本研究旨在探討TNNI3K在小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cell, mESC)向心肌細胞分化過程中的作用及相關分子機制,以期闡明TNNI3K與心肌細胞分化的關系。研究方法首先,通過檢測干細胞全能性表面標志物SSEA-1和Oct-4、堿性磷酸酯酶陽性試驗以及H.E染色實驗鑒定mESC的全能性。繼而,采用傳統的懸滴法培養(yǎng)mESC形成EB,除去LIF使其自分化為跳動的心肌細胞,通過real-time PCR檢測心肌細胞相關基因的相對表達量,western blotting檢測心肌細胞特異性標志物蛋白相對表達量,細胞免疫熒光檢測心肌細胞特異蛋白的定位表達,以及TEM觀察心肌細胞超微結構特異標志物肌纖維等方法鑒定所分化的心肌細胞。進一步,采用慢病毒分別攜帶hTNNI3K基因和siRNA永久性轉染mESC并分別分化為心肌細胞,通過real-time PCR檢測各組心肌細胞特異性基因的相對表達量,western blotting檢測心肌細胞特異性標志物蛋白的相對表達量,細胞免疫熒光共定位檢測心肌細胞特異性蛋白時空相對表達,FCM分選cTnT+細胞率等判斷hTNNI3K對心肌細胞分化的影響。此外,我們選取了Connexin40、Connexin45和Ctnt分別作為檢測了心房肌細胞、竇房結細胞和心室肌細胞表面標志物基因的相對表達量。最后,我們對hTNNI3K組、shRNA組以及各自對照組進行western blotting檢測MAPK信號通路相關蛋白的相對表達。研究結果研究結果表明,mESC表面蛋白分子SSEA-1和Oct-4表達呈陽性(綠色熒光),ALP高表達呈藍紫色,H.E染色核質比1。正常自分化的心肌細胞相關基因和蛋白表達呈現時空特性；分化16 d時細胞免疫熒光顯示MLC2、cTnI、cTnT以及a-actinin在胞漿高表達(綠色熒光),肌節(jié)清晰可見。TEM顯示心肌細胞獨有的肌纖維亞細胞結構。hTNNI3K組心肌細胞相關基因高表達(p0.05)。Western blotting顯示心肌特異性蛋白MLC2、cTnT、cTnI、α-actinin等顯著高于其對照組(p0.05),且細胞免疫熒光雙染結果顯示MHC6蛋白提前表達。FCM結果顯示cTnT+陽性細胞率顯著高于對照組(p0.05)。干擾shRNA組不僅cTnT+陽性細胞率顯著低于對照組(p0.05),而且心肌特異蛋白也顯著低于對照組(p0.05),MHC6蛋白表達延后。通過檢測Connexin45、Connexin40和Ctnt相對表達量,我們發(fā)現,這三個基因表達量無統計學差異(P0.05)。通過檢測MAPK信號通路相關蛋白發(fā)現,hTNNI3K組P-p38、P-ERK和P-JNK均被抑制,且P-P38和P-JNK蛋白抑制更明顯,而Flag-only組、shRNA組和non-sense RNA組信號通路蛋白均正常表達。結論TNNI3K基因過表達促進mESC向心肌細胞分化,且MAPK信號通路可能參與了該基因誘導mESC分化為心肌細胞的過程。
【學位授予單位】：北京協和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2

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