發(fā)布時(shí)間：2020-07-29 11:33

【摘要】：背景由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具備復(fù)雜的翻譯后修飾功能,因而廣泛應(yīng)用于重組藥物蛋白的生產(chǎn)。其中70%以上的重組藥物蛋白由中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。有許多因素影響重組藥物蛋白在CHO細(xì)胞中表達(dá),表達(dá)載體是其中影響重組蛋白表達(dá)水平和質(zhì)量的重要因素之一。當(dāng)外源基因轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞,轉(zhuǎn)基因會(huì)發(fā)生隨機(jī)整合,導(dǎo)致基因沉默及表達(dá)水平不穩(wěn)定,極大地影響了重組蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。因此對(duì)載體的優(yōu)化已成為國內(nèi)外研究的重點(diǎn)方向之一。目的分析弱化篩選標(biāo)記、不同順式作用元件結(jié)合篩選標(biāo)記對(duì)CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的影響及其分子機(jī)制。方法(1)將G418篩選標(biāo)記基因突變(G418 mutation,G418mut),與CMV和SV40兩種不同的啟動(dòng)子結(jié)合構(gòu)建表達(dá)載體。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞48h后,采用倒置熒光顯微鏡觀察增強(qiáng)綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,eGFP)熒光表達(dá)情況。G418篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞池,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)eGFP的表達(dá)。(2)克隆土撥鼠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element,WPRE)到含有CMV啟動(dòng)子的表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,觀察熒光表達(dá)情況,流式檢測(cè)eGFP表達(dá)。分析轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)以及mRNA表達(dá)水平。穩(wěn)定培養(yǎng)兩個(gè)月檢測(cè)其穩(wěn)定表達(dá)水平。(3)選擇四種常見的哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選標(biāo)記,殺稻瘟菌素、博來霉素、嘌呤霉素及潮霉素,進(jìn)行CHO細(xì)胞藥物敏感實(shí)驗(yàn);選擇周期較短的藥物抗性基因替換原載體中的G418抗性基因構(gòu)建新的載體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞,流式分析eGFP表達(dá)水平。(4)將載體中的eGFP報(bào)告基因克隆到G418抗性基因的上游,并在CMV啟動(dòng)子的下游克隆促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO),構(gòu)建含EPO及eGFP-G418嵌合基因的載體。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞;篩選穩(wěn)定細(xì)胞池;挑11株單克隆,熒光倒置顯微鏡下觀察其綠色熒光并標(biāo)記熒光信號(hào)強(qiáng)弱程度;流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)11株克隆的eGFP表達(dá)水平,分為高中低三組標(biāo)記,并與其分別對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較;Western blot檢測(cè)其中高中低細(xì)胞株的EPO表達(dá)水平;分析其蛋白表達(dá)水平是否與eGFP表達(dá)水平相關(guān)。結(jié)果(1)利用弱化的G418抗性基因成功構(gòu)建了兩個(gè)含不同啟動(dòng)子(CMV和SV40)的載體。轉(zhuǎn)染48h后的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示G418弱化基因在兩種不同啟動(dòng)子均可提高eGFP表達(dá)。穩(wěn)定表達(dá)結(jié)果分析表明,和對(duì)照相比,CMV+G418mut和SV40+G418mut均能提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。CMV啟動(dòng)子介導(dǎo)下,eGFP表達(dá)水平的提高尤為顯著,提高了2.62倍(P0.05)。(2)將CMV啟動(dòng)子介導(dǎo)下的載體插入WPRE基因片段后,CMV+G418mut+WPRE的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平相比CMV+G418有所下降。CMV+G418+WPRE的eGFP表達(dá)水平在所有載體中最高,提高3.02倍(P0.05)�？截悢�(shù)分析結(jié)果顯示:和對(duì)照相比,CMV+G418mut的拷貝數(shù)高達(dá)10.76倍。mRNA表達(dá)水平分析也顯示CMV+G418mut的mRNA表達(dá)水平最高,為對(duì)照的9.61倍。穩(wěn)定培養(yǎng)兩個(gè)月后,流式結(jié)果顯示,含有G418mut的載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)量下降最為明顯,而含有WPRE的載體表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定,仍呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平。(3)在篩選標(biāo)記選擇實(shí)驗(yàn)中殺稻瘟菌素(4-5d)和潮霉素B(10-12d)體現(xiàn)了較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì),能在較短時(shí)間內(nèi)將未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞胞全部殺死。構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,48h后熒光表達(dá)結(jié)果顯示含有殺稻瘟菌素抗性基因的載體被成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞,其轉(zhuǎn)染效率低于G418抗性基因,但是穩(wěn)定結(jié)果顯示其eGFP表達(dá)水平高于G418抗性基因。(4)由EPO-EGFP-G418嵌合基因載體篩選出的11株單克隆根據(jù)熒光強(qiáng)弱分為三組,與其分別對(duì)應(yīng)的eGFP表達(dá)結(jié)果相比較。結(jié)果顯示,熒光信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)的單克隆細(xì)胞株所對(duì)應(yīng)的eGFP表達(dá)水平也較高,成正相關(guān)。Western Blot結(jié)果分析得到eGFP表達(dá)水平較高的克隆株其EPO蛋白產(chǎn)量也相對(duì)較高。結(jié)論(1)G418突變能夠在不同啟動(dòng)子的介導(dǎo)下提高轉(zhuǎn)基因在CHO細(xì)胞里的表達(dá)水平。(2)WPRE順式作用表達(dá)元件能有效提高載體在CHO細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。其中CMV+G418+WPRE組合提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的效果最為顯著。(3)在四種篩選標(biāo)記中,殺稻瘟菌素具有明顯的優(yōu)勢(shì)。(4)利用eGFP嵌合篩選標(biāo)記能夠預(yù)測(cè)重組蛋白的表達(dá)水平。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78
【圖文】：

(16)一抗稀釋液配置：4μl 一抗+4MLTBST二抗稀釋液配置：4μl 二抗+4MLTBST1.2 方法1.2.1 載體構(gòu)建1.2.1.1 含 SV40 啟動(dòng)子的 pIRES-EGFP 載體的構(gòu)建通過亞克隆使 SV40 啟動(dòng)子（GenBank：LT727396.1）替換 CMV 啟動(dòng)子得到 SV40啟動(dòng)子啟動(dòng)的載體，即 SV40+G418。設(shè)計(jì)的 SV40 基因如附錄補(bǔ)充圖 1 所示。1.2.1.2 弱化載體構(gòu)建（1）突變 G418 抗性基因合成根據(jù)前期文獻(xiàn)報(bào)道[17,18]，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 cDNA 產(chǎn)物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）- 依賴性誘變將 261 處的氨基酸 D 突變?yōu)榘被?G，并且克隆到上述載體中。設(shè)計(jì)突變 G418 抗性基因如圖 1 所示，由安徽通用生物工程有限公司合成。

A 為 pIRES-EGFP 出發(fā)載體。B 為 CMV 和 SV40 啟動(dòng)子、G418 抗E 構(gòu)建的新載體。 Vector construction map. A :pIRES-EGFP vector; B :The new vectors with CMoters , G418 resistance genes and WPRE element..2 不同篩選標(biāo)記抗性基因載體的構(gòu)建將 pIRES-EGFP 中的 G418 分別替換為殺稻瘟菌素抗性基因（GenBan7245.1）、潮霉素 B 抗性基因（GenBank : JN596098.1），構(gòu)建兩個(gè)新由安徽通用生物有限公司合成，如附錄補(bǔ)充圖 4，圖 5 所示。

A 為 pIRES-EGFP 出發(fā)載體。B 為 CMV 和 SV40 啟動(dòng)子、G418 抗性 構(gòu)建的新載體。 Vector construction map. A :pIRES-EGFP vector; B :The new vectors with CMVters , G418 resistance genes and WPRE element.2 不同篩選標(biāo)記抗性基因載體的構(gòu)建將 pIRES-EGFP 中的 G418 分別替換為殺稻瘟菌素抗性基因（GenBank7245.1）、潮霉素 B 抗性基因（GenBank : JN596098.1），構(gòu)建兩個(gè)新載由安徽通用生物有限公司合成，如附錄補(bǔ)充圖 4，圖 5 所示。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉蘇;田md;王馳;姚文兵;;弱化抗性標(biāo)記篩選高表達(dá)CHO細(xì)胞株的方法建立[J];中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào);2015年05期

本文編號(hào)：2773906