【摘要】：葉綠體是植物進行光合作用的細胞器,葉綠體的發(fā)育與光合色素合成和光合作用有密切相關(guān)。水稻是單子葉模式植物,在水稻中葉色突變是比較常見的現(xiàn)象,因此水稻葉色突變材料是研究單子葉植物中光合色素合成與降解、葉綠體的發(fā)育以及結(jié)構(gòu)功能、光合作用以及光形態(tài)建成的理想材料。本研究利用EMS(ethyl methane sulfonate)誘變粳稻品種日本晴獲得的黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry340,并對gry340突變體進行了表型特征調(diào)查,光合色素的測定,以及葉綠體和線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察;然后對該突變體進行了分子標記定位、圖位克隆、亞細胞定位、轉(zhuǎn)基因互補驗證等分析;最后利用qRT-PCR等技術(shù)進一步探討了gry340突變基因的分子機理。主要研究結(jié)果如下:水稻gry340突變體在3葉期以前呈現(xiàn)黃化表型,以后隨著植株生長發(fā)育逐漸轉(zhuǎn)綠,到9葉期基本恢復(fù)到野生型的正常綠葉表型。gry340突變體的抽穗期延遲約9天,成熟后它的株高、單株有效穗、每穗粒數(shù)、穗長、結(jié)實率和千粒重分別比野生型減少10.9%、15.2%、25.1%、7.8%、21.7%和7.0%。不同發(fā)育時期的光合色素測定結(jié)果顯示,gry340突變體在3葉期的Chl a、Chl b、Chls和類胡蘿卜素的含量分別較野生型減少了67.6%、83.3%、71.7%和52.1%。隨著植株的生長,gry340突變體的Chl a、Chl b、Chls和類胡蘿卜素含量迅速增加,到9葉期和孕穗期時Chl a、Chl b、Chls和類胡蘿卜素的含量與野生型的差異不顯著。在23℃和30℃下gry340突變體幼苗均表現(xiàn)為黃化表型,其Chl a、Chl b、Chls和類胡蘿卜素的含量與野生型相比均顯著減少。上述表明gry340突變體中光合色素的變化是引起gry340突變體黃化轉(zhuǎn)綠表型的直接原因,該突變體是一個對溫度不敏感的葉色突變體。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示,gry340突變體在3葉期葉綠體數(shù)量與野生型相比無明顯的差異,但是突變體中的葉綠體內(nèi)呈現(xiàn)出絲狀的類囊體結(jié)構(gòu),沒有明顯的基粒垛疊,顯示葉綠體明顯發(fā)育不良。此外,在gry340突變體中線粒體的形態(tài)不正常,呈現(xiàn)出明顯的空泡狀結(jié)構(gòu),說明線粒體發(fā)育也受到明顯的抑制。在gry340突變體轉(zhuǎn)綠后,葉綠體和線粒體的發(fā)育恢復(fù)正常。遺傳分析表明該黃化轉(zhuǎn)綠突變性狀是受一對隱性核基因控制的。以gry340突變體與秈稻品種“明恢63”雜交得到的F_2作為定位群體,將gry340突變體精細定位于水稻第一染色體長臂上的InDel標記C4和C5之間的84 kb區(qū)域,該區(qū)域含有16個預(yù)測基因。候選基因測序結(jié)果顯示,gry340突變體中LOC_Os01g58790基因的DNA序列在2554位(對應(yīng)的CDS在575位)由胞嘧啶(C)突變?yōu)樾叵汆奏?T),從而造成所編碼的蛋白在第192個氨基酸發(fā)生突變,即GCT(丙氨酸ala)突變成GTT(纈氨酸Val)。該基因預(yù)測編碼GHMP激酶家族的IspE(4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤蘚糖醇激酶)。因此將該基因確定為導(dǎo)致gry340黃化轉(zhuǎn)綠突變表型的候選基因,命名為OsIspE。OsIspE在水稻中是單拷貝基因,DNA和cDNA全長分別為4834 bp和1206 bp,編碼分子量約為43.8 kDa的蛋白質(zhì)。水稻OsIspE與單子葉植物大麥、玉米和高粱的同源蛋白有更近的進化關(guān)系。亞細胞定位實驗說明OsIspE蛋白定位于水稻細胞的葉綠體上。利用野生型中OsIspE基因的全長CDS構(gòu)建表達載體pCAMBIA2300-OsIspE,進行了轉(zhuǎn)基因互補實驗證。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因株系在幼苗期呈現(xiàn)出正常綠色表型,其光合色素含量已經(jīng)恢復(fù)到野生型親本的水平,表明野生型IspE基因互補了gry340突變體表型,說明該突變體表型是由OsIspE單堿基突變引起的。qRT-PCR定量分析顯示,OsIspE基因?qū)儆诮M成型表達,在苗期的根和葉,以及孕穗期的根、莖、葉、葉鞘和幼穗中均有表達;其中在苗期,葉中的表達量較高;在孕穗期,葉中的表達量最高,其次是葉鞘,而在根中的相對表達量最低。野生型親本的IspE基因表達隨著生長發(fā)育顯著增加,在9葉期達到峰值,在孕穗期只下降大約一半;同時,gry340突變體中ispE的表達量隨著生長發(fā)育也顯著增加,在9葉期和孕穗期與野生型無顯著差異。利用gry340突變體與OsIspF基因突變體505ys進行雜交,獲得F_2分離群體。在F_2中純合的ispE ispF雙突變體呈現(xiàn)黃化致死表型,說明來自細胞質(zhì)MVA途徑的類異戊二烯前體物質(zhì)也不能有效補償葉綠體中MEP途徑的缺陷。為分析該雙突變體與野生型親本日本晴的基因表達差異,利用qRT-PCR檢測了30個相關(guān)基因的表達,包括7個MEP途徑基因、6個MVA途徑基因、8個光合作用相關(guān)基因及9個線粒體基因組編碼的電子傳遞復(fù)合體基因。結(jié)果顯示,在21個MEP、MVA途徑基因及光合作用相關(guān)基因中,僅psbA基因的表達量保持不變,ispE、HMGR1、HMGR2和psbP基因顯著上調(diào),其它16個基因的表達量顯著下調(diào)。在9個線粒體基因組編碼的電子傳遞復(fù)合體基因中,只有cox2和atp8基因的表達量顯著下調(diào),其它7個基因的表達量顯著上調(diào)。同時,我們也檢測了上述30個基因在gry340突變體中的表達情況,獲得了與ispE ispF雙突變體相似的結(jié)果,只有ispE、MPDC1、psbP、cox2和apt8等5個基因不同。結(jié)果表明,水稻MEP途徑基因的功能缺陷影響了MEP途徑中其它基因、MVA途徑基因、光合作用基因以及線粒體基因的表達。暗示突變受損的葉綠體和線粒體的反饋調(diào)節(jié)信號可能會影響上述基因的表達。
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S511
【圖文】：

圖 1-1 在植物細胞中類異戊二烯的兩條合成途徑ǐ（1）葉綠體中的 MEP 途徑合成的 IPP 用于合成葉綠素ǎ類胡蘿卜素和醌類化合物ǐ（2）細胞質(zhì)中的 MVA 途徑合成的 IPP 主要用于甾醇類和線粒體中泛醌類化合物的合成[9]ǐFig.1-1. Scheme showing the compartmentation of the two isoprenoid biosynthesis pathways in theplant cell:（1）the chloroplastic DOXP/MEP pathway for the biosynthesis of the active C5-units（IPP）for chlorophylls （phytyl side-chain）, carotenoids and prenylquinones （isoprenoid side-chains）, and（2） the cytosolic acetate/Mevalonate pathway of IPP biosynthesis for the formation of sterols and theprenyl side-chain of the mitochondrial ubiquinones.1.1.1 細胞質(zhì)中 MVA 合成途徑在上世紀中首先在動物和酵母中發(fā)現(xiàn)了 MVA 途徑，主要存在于細胞質(zhì)中，因此又稱為細胞質(zhì)途徑（cytosolic pathway）[10]（圖 1-1）ǐMVA 途徑中萜類化合物首先是兩分子的乙酰輔酶 A（CoA, acetyl coenzymeA）在乙酰輔酶 A 乙�；D(zhuǎn)移酶（AACT，acetyl CoA acetyl-transferase）的催化下縮合為乙酰乙酰輔酶 A，再經(jīng) HMG-CoA 合成

日本晴與 gry340 突變體的表型ǐ（A）苗期；（B）6 葉期；（C）分蘗期otypes of the gry340 mutant and its wild-type parent Nipponbare. (A) Seedhe six-leaf stage. (C) Tillering stage. (D) Grain-filling stage.0.00.51.01.52.02.5 WT gry3400.20.40.6BD********0.00.71.42.12.83.50.20.40.60.8AC******Chlbcontent(mg/gFW)Chlcontent(mg/gFW)Carcontent(mg/gFW)Chlacontent(mg/gFW)gry34WTgry340

得的陽性轉(zhuǎn)基因植株在苗期呈現(xiàn)與野生型親本一）ǐ我們選取在苗期表現(xiàn)一致的陽性植株進行光合株的總?cè)~綠素ǎChl aǎChl b 和類胡蘿卜素的含在灌漿結(jié)實期轉(zhuǎn)基因陽性植物表型與野生型的表生型中的 OsIspE（LOC_Os01g58790）基因能夠恢明了該突變體的表型是由于 OsIspE 基因序列在

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