【摘要】：大白菜是異花授粉作物,雜種優(yōu)勢明顯,雜交制種已成為國內外大白菜抗病、優(yōu)質、穩(wěn)產育種的首要措施。前期通過抑制差減雜交技術(SSH)在大白菜雄性不育兩用系‘A02’中找到一段有顯著性差異的基因片段,通過NCBI比對,發(fā)現與擬南芥SKS13(At3g13400)同源性最高,故命名為BrSKS13。本研究通過qRT-PCR,原位雜交進行表達模式分析預測了BrSKS13的生物學功能;通過對擬南芥同源缺失突變體sks13花粉表型及花粉萌發(fā)等實驗鑒定了該基因的功能;將BrSKS13基因轉入擬南芥同源缺失突變體sks13,進一步驗證功能恢復。主要結果如下:1.為了確定BrSKS13的時空表達模式,利用RT-PCR技術分析了它在大白菜可育株和不育株的根、莖、葉和花蕾中的表達情況,發(fā)現在可育株花蕾中有較高表達;又對該基因在可育花蕾的花瓣、花萼、花藥和雌蕊中的表達情況進行分析,發(fā)現在花藥中有較高表達;進一步分析該基因在花藥六個等級中的表達情況,發(fā)現表達量隨著花藥等級的增加表現為上調。表明BrSKS13是花蕾發(fā)育相關基因,可能參與花藥的發(fā)育。應用qRT-PCR分析可育5級花蕾向不育株授粉0h,1h,2h,4h,8h,12h,16h和24h后的嫩角果,發(fā)現BrSKS13仍能持續(xù)表達,并且隨著授粉時間的推移表達量先下降,當達到4h時,表達量迅速增加,而后又下降。進而應用原位雜交技術對BrSKS13進行分析,在授粉后的柱頭中能檢測到該基因,表明該基因參與花粉管的生長。2.從TAIR網站上購買了擬南芥突變體sks13,采用“三引物法”鑒定出純合突變體。通過對純合突變體表型的觀察,發(fā)現與野生型擬南芥相比,突變植株在營養(yǎng)生長階段與野生型沒有明顯的差異,當進入生殖生長階段時,突變體植株略顯矮小,抽薹數量比較少,說明SKS13的缺失可能影響了擬南芥某些生殖發(fā)育過程。通過觀察純合突變體花粉粒表型和花粉萌發(fā)實驗,發(fā)現擬南芥SKS13的缺失會導致少數花粉發(fā)育不良,花粉不能正常萌發(fā)。進而對突變體的結莢情況進行觀察,發(fā)現與野生型相比,突變體的結莢率比較低,且角果長度較短,卻略顯粗壯,表明SKS13的缺失影響了擬南芥的正常結莢。3.利用構建的過表達載體,通過根癌農桿菌介導轉化法,把BrSKS13基因轉入擬南芥純合突變體sks13中,并篩選出轉基因植株。BrSKS13基因在擬南芥中的表達模式分析可見,轉BrSKS13的擬南芥在花藥上出現GUS信號,說明BrSKS13與花藥發(fā)育相關。對轉基因植株,純合突變體和野生型進行觀察,發(fā)現轉基因植株與突變體相比,抽薹數量增多、結莢數目增加、角果長度增長、花粉正常發(fā)育、種子數量增多等,而與野生型沒有明顯的差異。這說明BrSKS13的插入可以使突變體的表型恢復。綜上所述,BrSKS13可能參與了花粉發(fā)育和結莢等過程。
【學位授予單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S634.1
【圖文】：

沈陽農業(yè)大學碩士學位論文可育和不育株各個組織的表達’可育株和不育株的須根、塊根、莖、葉和花蕾為材料按及反轉錄成 cDNA 進行 RT-PCR 分析，結果如圖 2-2 所的花蕾的表達量較高，條帶比較清晰且明亮；然而在不他部位（花蕾除外）條帶比較微弱或沒有條帶，表明目或沒有表達。而 Brlact7 基因在可育株和不育株的任何似，表明 Brlact7 基因在這些材料中表達沒有差異，表因的內參是可靠的。說明 BrSKS13 在可育株花蕾中表達量較低，幾乎不表達是可靠的，是育性相關基因。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

可育株和不育株各級花藥的表達2’可育株和不育株的Ⅰ-Ⅵ級花藥，獲取其 cDNA，如圖 2-4 所示，Brlact7 基因大白菜植株的各級花藥可育株各個分級的花藥中均表達比較明顯，并且隨 BrSKS13 在花藥的發(fā)育過程中持續(xù)表達并推測 B 2-3 BrSKS13 和 Brlact7 在可育株 各個花器官的 差異ent expression of BrSKS13 and Brlact7 in different fertile plants00 marker；1、2、3、4、5，分 別 為 可 育 植 株 的 花 絲 、 花 瓣 、ote: M, DL2000 marker; 1, filaments; 2, Petals; 3, Sepals; 4, Pistils; 5, StM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

育株和不育株各級花藥的表達可育株和不育株的Ⅰ-Ⅵ級花藥，獲取其 cDNA，做如圖 2-4 所示，Brlact7 基因大白菜植株的各級花藥中可育株各個分級的花藥中均表達比較明顯，并且隨著 BrSKS13 在花藥的發(fā)育過程中持續(xù)表達并推測 BrS-3 BrSKS13 和 Brlact7 在可育株 各個花器官的 差異表t expression of BrSKS13 and Brlact7 in different flfertile plants marker；1、2、3、4、5，分 別 為 可 育 植 株 的 花 絲 、 花 瓣 、 花e: M, DL2000 marker; 1, filaments; 2, Petals; 3, Sepals; 4, Pistils; 5, StamM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 叢漢卿;徐立;信彩云;李志英;;植物漆酶的研究進展[J];安徽農業(yè)科學;2009年18期

相關博士學位論文 前1條

1 張_";十字花科植物BcMF2和BcMF4同源基因的克隆、表達及其進化關系研究[D];浙江大學;2005年

相關碩士學位論文 前2條

1 辛喜鳳;復等位基因遺傳大白菜核雄性不育相關基因的分離與表達分析[D];沈陽農業(yè)大學;2012年

2 張志仙;白菜花粉特異基因BcSKS11在花粉發(fā)育及授粉受精中的表達分析及功能鑒定[D];浙江大學;2011年

本文編號：2772345