【摘要】：大白菜是異花授粉作物,雜種優(yōu)勢(shì)明顯,雜交制種已成為國(guó)內(nèi)外大白菜抗病、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)產(chǎn)育種的首要措施。前期通過(guò)抑制差減雜交技術(shù)(SSH)在大白菜雄性不育兩用系‘A02’中找到一段有顯著性差異的基因片段,通過(guò)NCBI比對(duì),發(fā)現(xiàn)與擬南芥SKS13(At3g13400)同源性最高,故命名為BrSKS13。本研究通過(guò)qRT-PCR,原位雜交進(jìn)行表達(dá)模式分析預(yù)測(cè)了BrSKS13的生物學(xué)功能;通過(guò)對(duì)擬南芥同源缺失突變體sks13花粉表型及花粉萌發(fā)等實(shí)驗(yàn)鑒定了該基因的功能;將BrSKS13基因轉(zhuǎn)入擬南芥同源缺失突變體sks13,進(jìn)一步驗(yàn)證功能恢復(fù)。主要結(jié)果如下:1.為了確定BrSKS13的時(shí)空表達(dá)模式,利用RT-PCR技術(shù)分析了它在大白菜可育株和不育株的根、莖、葉和花蕾中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在可育株花蕾中有較高表達(dá);又對(duì)該基因在可育花蕾的花瓣、花萼、花藥和雌蕊中的表達(dá)情況進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在花藥中有較高表達(dá);進(jìn)一步分析該基因在花藥六個(gè)等級(jí)中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)表達(dá)量隨著花藥等級(jí)的增加表現(xiàn)為上調(diào)。表明BrSKS13是花蕾發(fā)育相關(guān)基因,可能參與花藥的發(fā)育。應(yīng)用qRT-PCR分析可育5級(jí)花蕾向不育株授粉0h,1h,2h,4h,8h,12h,16h和24h后的嫩角果,發(fā)現(xiàn)BrSKS13仍能持續(xù)表達(dá),并且隨著授粉時(shí)間的推移表達(dá)量先下降,當(dāng)達(dá)到4h時(shí),表達(dá)量迅速增加,而后又下降。進(jìn)而應(yīng)用原位雜交技術(shù)對(duì)BrSKS13進(jìn)行分析,在授粉后的柱頭中能檢測(cè)到該基因,表明該基因參與花粉管的生長(zhǎng)。2.從TAIR網(wǎng)站上購(gòu)買了擬南芥突變體sks13,采用“三引物法”鑒定出純合突變體。通過(guò)對(duì)純合突變體表型的觀察,發(fā)現(xiàn)與野生型擬南芥相比,突變植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段與野生型沒(méi)有明顯的差異,當(dāng)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段時(shí),突變體植株略顯矮小,抽薹數(shù)量比較少,說(shuō)明SKS13的缺失可能影響了擬南芥某些生殖發(fā)育過(guò)程。通過(guò)觀察純合突變體花粉粒表型和花粉萌發(fā)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)擬南芥SKS13的缺失會(huì)導(dǎo)致少數(shù)花粉發(fā)育不良,花粉不能正常萌發(fā)。進(jìn)而對(duì)突變體的結(jié)莢情況進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)與野生型相比,突變體的結(jié)莢率比較低,且角果長(zhǎng)度較短,卻略顯粗壯,表明SKS13的缺失影響了擬南芥的正常結(jié)莢。3.利用構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體,通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法,把BrSKS13基因轉(zhuǎn)入擬南芥純合突變體sks13中,并篩選出轉(zhuǎn)基因植株。BrSKS13基因在擬南芥中的表達(dá)模式分析可見,轉(zhuǎn)BrSKS13的擬南芥在花藥上出現(xiàn)GUS信號(hào),說(shuō)明BrSKS13與花藥發(fā)育相關(guān)。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株,純合突變體和野生型進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株與突變體相比,抽薹數(shù)量增多、結(jié)莢數(shù)目增加、角果長(zhǎng)度增長(zhǎng)、花粉正常發(fā)育、種子數(shù)量增多等,而與野生型沒(méi)有明顯的差異。這說(shuō)明BrSKS13的插入可以使突變體的表型恢復(fù)。綜上所述,BrSKS13可能參與了花粉發(fā)育和結(jié)莢等過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S634.1
【圖文】：

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文可育和不育株各個(gè)組織的表達(dá)’可育株和不育株的須根、塊根、莖、葉和花蕾為材料按及反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 進(jìn)行 RT-PCR 分析，結(jié)果如圖 2-2 所的花蕾的表達(dá)量較高，條帶比較清晰且明亮；然而在不他部位（花蕾除外）條帶比較微弱或沒(méi)有條帶，表明目或沒(méi)有表達(dá)。而 Brlact7 基因在可育株和不育株的任何似，表明 Brlact7 基因在這些材料中表達(dá)沒(méi)有差異，表因的內(nèi)參是可靠的。說(shuō)明 BrSKS13 在可育株花蕾中表達(dá)量較低，幾乎不表達(dá)是可靠的，是育性相關(guān)基因。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

可育株和不育株各級(jí)花藥的表達(dá)2’可育株和不育株的Ⅰ-Ⅵ級(jí)花藥，獲取其 cDNA，如圖 2-4 所示，Brlact7 基因大白菜植株的各級(jí)花藥可育株各個(gè)分級(jí)的花藥中均表達(dá)比較明顯，并且隨 BrSKS13 在花藥的發(fā)育過(guò)程中持續(xù)表達(dá)并推測(cè) B 2-3 BrSKS13 和 Brlact7 在可育株 各個(gè)花器官的 差異ent expression of BrSKS13 and Brlact7 in different fertile plants00 marker；1、2、3、4、5，分 別 為 可 育 植 株 的 花 絲 、 花 瓣 、ote: M, DL2000 marker; 1, filaments; 2, Petals; 3, Sepals; 4, Pistils; 5, StM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

育株和不育株各級(jí)花藥的表達(dá)可育株和不育株的Ⅰ-Ⅵ級(jí)花藥，獲取其 cDNA，做如圖 2-4 所示，Brlact7 基因大白菜植株的各級(jí)花藥中可育株各個(gè)分級(jí)的花藥中均表達(dá)比較明顯，并且隨著 BrSKS13 在花藥的發(fā)育過(guò)程中持續(xù)表達(dá)并推測(cè) BrS-3 BrSKS13 和 Brlact7 在可育株 各個(gè)花器官的 差異表t expression of BrSKS13 and Brlact7 in different flfertile plants marker；1、2、3、4、5，分 別 為 可 育 植 株 的 花 絲 、 花 瓣 、 花e: M, DL2000 marker; 1, filaments; 2, Petals; 3, Sepals; 4, Pistils; 5, StamM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 叢漢卿;徐立;信彩云;李志英;;植物漆酶的研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年18期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張_";十字花科植物BcMF2和BcMF4同源基因的克隆、表達(dá)及其進(jìn)化關(guān)系研究[D];浙江大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 辛喜鳳;復(fù)等位基因遺傳大白菜核雄性不育相關(guān)基因的分離與表達(dá)分析[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

2 張志仙;白菜花粉特異基因BcSKS11在花粉發(fā)育及授粉受精中的表達(dá)分析及功能鑒定[D];浙江大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2772345