【摘要】：ATP結合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉運蛋白屬于膜整合蛋白超家族,遍布于原核和真核生物中,借助水解ATP得到的能量運輸底物分子進出胞內外實現功能。動物中的多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)是起先得到學者普遍關注的ABC轉運蛋白類型。研究證實在植物中,外源物質、植物激素、金屬離子、脂類和次級代謝物是ABC轉運蛋白的主要轉運底物。本研究首先對鉛處理下苦蕎種子萌發(fā)實驗和盆栽實驗中苦蕎葉片的生理形態(tài)指標進行分析,并依據鉛處理環(huán)境下的苦蕎葉片轉錄組數據,通過實時定量驗證重金屬鉛處理條件下差異表達ABC轉運蛋白基因(Ft ABCB1、FtABCC9、FtABCG11和FtABCG15)表達特征,通過RT-PCR克隆表達存在差異的苦蕎ABC轉運蛋白基因的開放閱讀框,并對基因序列進行生物學分析;構建基于pYES2的酵母表達載體,在重金屬敏感釀酒酵母突變菌株ycf1中驗證各ABC轉運蛋白的功能;構建基于pCAMBIA3301的植物表達載體,在擬南芥中進行過量表達,研究為深入闡釋ABC轉運蛋白在苦蕎植物重金屬富集和解毒中的機理提供基礎。本研究得到的主要結論有:(1)在0mg/L-1600mg/L的硝酸鉛濃度范圍內,鉛處理對苦蕎種子的發(fā)芽率無明顯影響;在0g/kg-15g/kg的硝酸鉛濃度范圍內,鉛處理對植株的生長發(fā)育無明顯影響,但對苦蕎萌發(fā)期胚根伸長和成株期的株高有抑制作用;鉛處理導致苦蕎葉片部位游離脯氨酸含量降低,誘導丙二醛含量、可溶性蛋白含量和的可溶性糖含量(還原糖除外)顯著增加,隨著鉛濃度的增加,SOD和CAT活性先升高后降低,這些指標變化表明在一定濃度鉛處理下苦蕎葉片生物膜系統受到傷害,但苦蕎良好的生理基礎使其能在低鉛濃度下應對脅迫�？嗍w生物量大,生長周期短,較好的耐鉛性使其成為有潛力可開發(fā)的生物修復植物。(2)轉錄組數據分析顯示,FtABCB1、FtABCC9、FtABCG11和FtABCG15在重金屬脅迫條件下表達上調;實時定量分析表明FtABCC9、FtABCG11和Ft ABCG15均在葉片中表達最高,分別為根的4.9、23.6和3.5倍。而FtABCB1在根、莖和葉中的表達相近。在鉛處理下定量分析表明,4個基因在根,莖和葉中均有上調,其中,在硝酸鉛為10g/kg土和15g/kg土的處理根中,FtABCC9和FtABCG11上調最多,分別是對照的7.7和3.9倍。而在10g/kg土的硝酸鉛處理葉中,FtABCG15和FtABCB1上調最多,分別是對照的6倍、3.7倍,表明不同ABC基因組織表達特性及對鉛脅迫的響應存在差異。(3)苦蕎ABC轉運蛋白基因FtABCB1、FtABCC9、FtABCG11和FtABCG15的編碼序列分別為4047bp、4476bp、2121bp和2061bp,分別編碼147.3kDa、166.6kDa、78kDa和76kDa的蛋白。氨基酸分析顯示其含有ABC轉運蛋白典型的WalkerA基序、WalkerB基序以及ABC特征基序。跨膜結構分析表明Ft ABCB1和FtABCC9為正向全分子ABC轉運蛋白,FtABCG11和FtABCG15為反向半分子ABC轉運蛋白。(4)在重金屬敏感釀酒酵母ycf1的功能互補顯示在初始接菌量相同的條件下,實驗組轉化pYES2-FtABCB1、pYES2-FtABCG11和pYES2-FtABCG15的酵母生長速度明顯較對照組轉化空載體pYES2的酵母緩慢。推測ABC轉運蛋白對酵母產生細胞毒性從而抑制其生長,因而該表達系統可能不適合來驗證ABC基因的功能。(5)構建融合GFP的植物表達載體,通過洋蔥表皮亞細胞定位實驗表明FtABCB1、FtABCC9、FtABCG11和FtABCG15可能均位于細胞質膜。分別獲得轉基因FtABCG11和FtABCB1的T0代、轉基因FtABCG15的T2代擬南芥陽性植株,為深入研究苦蕎ABC轉運蛋白基因的重金屬抗性功能奠定基礎。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S517
【圖文】：

圖 1-2 NBD 結構域的氨基酸序列特征Figure 1-2 Amino acid sequence characteristics of NBD domain結構域數量和排序方法的差別，ABC 轉運蛋白被分成 2 類，其一為全一條獨立肽鏈含有兩個“NBD-TMD”，排布為(TMD-NBD-TMD-NBD

圖 1-1 ABC 轉運蛋白結構Figure 1-1 structure ofABC transporterD的跨膜結構域(Dean et al. 2001)，解，不同家族成員之間顯示了 30大致 200 個氨基酸殘基并含有三個

圖 1-3 Oldham 等提出的 ABC 轉運蛋白的作用機理re 1-3 The mechanism of action ofABC transporters proposed by Oldham e運蛋白的分類 轉運蛋白最初是從擬南芥中克隆得到的，基于模式植物的基

【參考文獻】

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本文編號：2768642