【摘要】：香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)是我國(guó)最重要的商業(yè)化栽培的食用菌之一。但栽培期間環(huán)境溫度過(guò)高,會(huì)影響菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育,甚至導(dǎo)致菌棒腐爛,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。前人研究表明,鄰氨基苯甲酸合酶(EC:4.1.3.27)(anthranilate synthase,TrpE)是生物體內(nèi)一種重要的逆境誘導(dǎo)蛋白,對(duì)嗜熱鏈球菌(Thermus thermophilus)在高溫環(huán)境下的生存能力具有十分重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),香菇栽培菌株S606在40℃脅迫24h后,鄰氨基苯甲酸合酶(LeTrpE)蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)大幅度上調(diào),但轉(zhuǎn)錄水平卻明顯下降,尤其在培養(yǎng)基中添加鄰氨基苯甲酸能提高菌絲耐熱能力,因此推測(cè)鄰氨基苯甲酸合酶基因(LetrpE)在香菇熱脅迫中可能發(fā)揮了重要作用(未發(fā)表數(shù)據(jù))。本課題分別采用RNAi和超表達(dá)技術(shù)對(duì)鄰氨基苯甲酸合酶基因在香菇中的功能進(jìn)行了初步研究。本研究以香菇栽培菌株S606為試驗(yàn)材料,以表達(dá)潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300-g為載體骨架。以LeTrpE功能結(jié)構(gòu)保守區(qū)域395bp的反向互補(bǔ)片段為干擾片段,構(gòu)建以Legpd和Leactin雙向啟動(dòng)子的RNAi載體;以LetrpE基因cDNA為超表達(dá)的目的片段,構(gòu)建以Leactin為啟動(dòng)子的超表達(dá)載體。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化香菇菌株S606,在潮霉素培養(yǎng)基上經(jīng)5次篩選獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子。將得到的轉(zhuǎn)化子采用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,獲得11個(gè)RNAi轉(zhuǎn)化子及20個(gè)超表達(dá)轉(zhuǎn)化子。對(duì)RNAi轉(zhuǎn)化子進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,發(fā)現(xiàn)LetrpE-i-37和LetrpE-i-53兩個(gè)轉(zhuǎn)化子LetrpE基因的表達(dá)量下調(diào)至野生型菌株的29.33%和42.78%,確認(rèn)它們?yōu)長(zhǎng)etrpE基因的RNAi轉(zhuǎn)化子;上述兩個(gè)RNAi轉(zhuǎn)化子的菌絲體在40℃處理24h后,檢測(cè)到吲哚-3-乙酸合成途徑中LetrpB、LeTam-1和LeYUCCA基因表達(dá)量均出現(xiàn)了下調(diào),且熱處理后菌絲體25℃下不能恢復(fù)生長(zhǎng),但野生型S606菌株可以恢復(fù)生長(zhǎng)。對(duì)超表達(dá)轉(zhuǎn)化子實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,發(fā)現(xiàn)LetrpE-o-11,LetrpE-o-13和LetrpE-o-14等3個(gè)轉(zhuǎn)化子的LetrpE基因表達(dá)量較野生型菌株上調(diào)2~3倍,確認(rèn)它們?yōu)長(zhǎng)etrpE基因的超表達(dá)轉(zhuǎn)化子;qRT-PCR分析表明,3個(gè)超表達(dá)轉(zhuǎn)化子吲哚-3-乙酸合成途徑中基因LetrpB和LeTam-1基因的表達(dá)量均上調(diào)2倍以上,生長(zhǎng)素合成基因LeYUCCA表達(dá)量上調(diào)10倍以上;3個(gè)超表達(dá)轉(zhuǎn)化子菌絲體在41℃熱處理24h后可以恢復(fù)生長(zhǎng),但野生型S606菌絲體在25℃時(shí)不能恢復(fù)生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明,香菇LetrpE基因位于吲哚-3-乙酸合成途徑上游,且能夠影響香菇菌株的耐熱性。本研究對(duì)深刻揭示香菇耐熱的分子機(jī)制和遺傳基礎(chǔ),開(kāi)展香菇耐熱新品種選育,都具有十分重要的科學(xué)意義和實(shí)踐價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S646.12
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文1.3.2 鄰氨基苯甲酸合酶結(jié)構(gòu)TrpE 由α亞基和β亞基組合的復(fù)合酶，等電點(diǎn) 5.1，分子質(zhì)量為 143000 Da（Poulsen et al 1993）。TrpE 的α亞基是催化反應(yīng)的關(guān)鍵亞基，能夠獨(dú)立地催化氨基與分支酸，生成鄰氨基苯甲酸，其活性受色氨酸的反饋抑制；β亞基為α亞基的催化提供氨基，作用是催化谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸。TrpE 的α亞基和β亞基都參了谷氨酰胺依賴的鄰氨基苯甲酸反應(yīng)，大量的游離氨基存在時(shí)，α亞基也可以單獨(dú)的催化合成鄰氨基苯甲酸（圖 1-1）（Romero et al 1995）。這 2 個(gè)反應(yīng)且都需要 Mg2+作為輔因子（Niyogi & Fink 1992）。Kanno et al（2004）體外重構(gòu)了水稻 TrpE 的同工酶，動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，即使以 NH4+作為氨基供體時(shí)，α亞基也需要與β亞基結(jié)合才能獲得最大酶活。

3 結(jié)果與分析3.1 LeTrpE 蛋白結(jié)構(gòu)和同源性分析以香菇單核體全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，將 LetrpE 基因蛋白序列提交至 NCBIConserved Domian Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），分析 LeTrpE 蛋白的結(jié)構(gòu)組成（圖 3-1），發(fā)現(xiàn) LeTrpE 蛋白包含 424 個(gè)氨基酸，屬于 Chorismate_bind super family（54-409 AA），其中 54-133 為 LeTrpE 結(jié)構(gòu)保守域。二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白以α-螺旋（11 個(gè)）和β-轉(zhuǎn)角（17 個(gè)）為主；Interpro 蛋白功能預(yù)測(cè) LeTrpE 分子量是 47.00kDa，等電點(diǎn)為 6.37，參與細(xì)胞內(nèi)色氨酸代謝過(guò)程。在 NCBI 上通過(guò) CDS 翻譯的氨基酸序列對(duì) LeTrpE 蛋白進(jìn)行同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)香菇 LeTrpE 和其它真菌的蛋白的同源性差異較大，說(shuō)明是一種比較獨(dú)特的蛋白（圖 3-2）。

于 Chorismate_bind super family（54-409 AA），其中 54-133 為 LeTrpE 結(jié)構(gòu)保守域二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白以α-螺旋（11 個(gè)）和β-轉(zhuǎn)角（17 個(gè)為主；Interpro 蛋白功能預(yù)測(cè) LeTrpE 分子量是 47.00kDa，等電點(diǎn)為 6.37，參與細(xì)胞內(nèi)色氨酸代謝過(guò)程。在 NCBI 上通過(guò) CDS 翻譯的氨基酸序列對(duì) LeTrpE 蛋白進(jìn)同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)香菇 LeTrpE 和其它真菌的蛋白的同源性差異較大，說(shuō)明一種比較獨(dú)特的蛋白（圖 3-2）。圖 3-1 香菇 LeTrpE 蛋白功能結(jié)構(gòu)域Fig 3-1 Functional motif of LeTrpE in L.edodes

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉海濤;舒端陽(yáng);;摭談中學(xué)生物實(shí)驗(yàn)中的“顏色”[J];中學(xué)生物教學(xué);2017年13期

2 姜偉東,匡達(dá)人;用YEPD豐富培養(yǎng)基篩選酵母PR03~+轉(zhuǎn)化子的方法[J];科學(xué)通報(bào);1988年06期

3 吳蕓,張素琴,馬國(guó)華,宋冬林,趙姬勇;萘質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中合成靛藍(lán)的研究[J];遺傳學(xué)報(bào);1989年04期

4 ;生物防治因子[J];生物技術(shù)通報(bào);1989年01期

5 王海艷;李保華;張清明;李桂舫;董向麗;王彩霞;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)蘋果炭疽病菌的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子鑒定[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年09期

6 王璐;許贛榮;王武;;根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化紅曲菌及轉(zhuǎn)化子發(fā)酵性能的研究[J];工業(yè)微生物;2011年04期

7 孟銳奇,姚湘燕;改良細(xì)胞破碎法快速檢測(cè)轉(zhuǎn)化子DNA[J];獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1991年04期

8 陸雁;王青艷;朱綺霞;秦艷;申乃坤;廖思明;謝能中;黃日波;;枯草芽孢桿菌高效轉(zhuǎn)化及其轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證方法[J];廣西科學(xué)院學(xué)報(bào);2012年02期

9 李麗s

本文編號(hào)：2764736