發(fā)布時間：2020-07-21 15:15

【摘要】：植物在生長過程中,基因組不斷復(fù)制但不進行有絲分裂而導(dǎo)致細胞倍性水平升高的過程稱為核內(nèi)復(fù)制。核內(nèi)復(fù)制通過細胞、代謝和遺傳效應(yīng)在生理及發(fā)育過程中起重要作用。干旱被認為是導(dǎo)致全球作物產(chǎn)量大幅減少的不利條件之一,因此鑒定出調(diào)節(jié)抗旱性相關(guān)的新型遺傳因子可能是提高作物生產(chǎn)力的先決條件。與其他常見作物相比(如小麥和玉米等),棉花被認為是一種適應(yīng)干旱脅迫先驅(qū)作物,這在一定程度上為我們提供了一個極好的模式植物,來描述植物中調(diào)節(jié)耐旱性的潛在新基因。在本研究中,我們從亞洲棉中發(fā)現(xiàn)了編碼DNA拓撲異構(gòu)酶ⅥB亞基的GaTOP6B基因,其參與調(diào)控細胞的核內(nèi)復(fù)制過程,同時還影響植物對干旱的響應(yīng)。本實驗中使用了病毒誘導(dǎo)基因沉默(ⅥGS)技術(shù)降低亞洲棉中GaTOP6B的表達,還通過花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子驅(qū)動GaTOP6B在擬南芥中超表達,分析GaTOP6B對細胞核內(nèi)復(fù)制和植物耐旱性的潛在影響。結(jié)果如下:1、從亞洲棉分離出AtTOP6B同源基因并命名為GaTOP6B。GaTOP6B的ORF長2010 bp,編碼669個氨基酸。其蛋白序列含有GHKL、H2TH和Transducer三個高度保守的結(jié)構(gòu)域,除棉屬外,與可可、長果黃麻在進化上親緣關(guān)系最近。2、在亞洲棉的根莖葉中均有GaTOP6B基因的表達,葉中的表達量最高。洋蔥表皮的亞細胞定位顯示GaTOP6B定位于細胞核上。3、將亞洲棉中GaTOP6B基因通過ⅥGS技術(shù)降低表達量后,植株表現(xiàn)出矮小的癥狀。流式細胞術(shù)檢測顯示其核內(nèi)復(fù)制水平降低并伴隨著核體積的減小。此外,斷水20天后,GaTOP6B沉默的亞洲棉葉片表現(xiàn)出更加萎蔫的狀態(tài),其脯氨酸、葉綠素含量及抗氧化酶活性降低,丙二醛含量增加,氣孔開度較大并伴隨著較低的葉片相對含水量和較高的失水率。脅迫相關(guān)基因P5CS,RD22,DREB1A,NCED3的表達水平降低。4、超表達GaTOP6B的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型相比有著較高的生長活性。流式細胞術(shù)檢測顯示其核內(nèi)復(fù)制水平較高并伴隨著核體積的增大。斷水14天后,轉(zhuǎn)基因擬南芥萎蔫癥狀不明顯,其脯氨酸含量較野生型擬南芥高。氣孔先于野生型擬南芥閉合并伴隨著較高的葉片相對含水量和較低的失水率。脅迫相關(guān)基因RD29,NCED3,COR15A,DREB1A的表達水平升高。5、超表達GaTOP6B的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示,與野生型擬南芥相比,轉(zhuǎn)基因擬南芥中的基因有著較高的轉(zhuǎn)錄活性。在200 mM的甘露醇處理后,轉(zhuǎn)基因擬南芥中的差異基因主要與代謝相關(guān),其編碼蛋白質(zhì)并在脅迫耐受中起作用,包括植物防御素、細胞壁生物合成、海藻糖生物合成和谷胱甘肽代謝等,通過誘導(dǎo)生理、生化如增強的防御、細胞壁增厚、滲透調(diào)節(jié)和清除ROS來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S562
【圖文】：

復(fù)制制又稱為核內(nèi)再復(fù)制，是多細胞真核生物的一種細胞周包括完整的基因組復(fù)制（S 期），但缺乏 M 期的染色體分 期特異性特征[1, 2]，細胞不斷重復(fù)地復(fù)制其 DNA 而跳過胞質(zhì)分裂，最終導(dǎo)致細胞的多倍化（圖 1）[3]。核內(nèi)復(fù)制控，從而有助于植物器官生長并促進植物產(chǎn)量[4]。細s）與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的復(fù)合物活性是轉(zhuǎn)換[5]。為了結(jié)束有絲分裂進程并進入核內(nèi)循環(huán)，一些 C必須下調(diào)，這個過程在真核生物中是非常保守的[2, 6]。會導(dǎo)致細胞基本特性的變化（如細胞增大和細胞得快速在植物體的生長發(fā)育和生理過程中有著重要的作用[8, 9]。數(shù)量的增加，特定細胞的代謝需求可以通過增加基因組如通過全基因組表達增加或者通過代謝途徑中基因的差制在細胞分化或適應(yīng)脅迫中同樣發(fā)揮著重要的作用[10]。

圖 2.1 GaTOP6B 的 cDNA 部分片段克�。ˋ）和 GaTOP6B 的 ORF 全長克�。˙）.3.2 基于 VIGS 系統(tǒng) pTRV2-GaTOP6B 和過表達 pCAMBIA1300-GaTOP載體的構(gòu)建將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳跑膠檢測表明目的片段均已克隆出來（圖2.2A和目的片段切膠回收后由上海生工生物公司測序后經(jīng)比對確認擴增片段為構(gòu)體所需要的片段。將目的片段與載體連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，提質(zhì)粒后分 KpnⅠ/EcoRⅠ和 PstⅠ/KpnⅠ酶切驗證鑒定陽性克隆，驗證正確后將重組質(zhì)化入農(nóng)桿菌保存，即獲得用于VIGS 系統(tǒng)中沉默GaTOP6B的pTRV2-GaTOP 組 質(zhì) 粒 和 用 于 構(gòu) 建 超 表 達 GaTOP6B 轉(zhuǎn) 基 因 擬 南 芥AMBIA1300-GaTOP6B 重組質(zhì)粒。

圖 2.1 GaTOP6B 的 cDNA 部分片段克�。ˋ）和 GaTOP6B 的 ORF 全長克隆（B）2.3.2 基于 VIGS 系統(tǒng) pTRV2-GaTOP6B 和過表達 pCAMBIA1300-GaTOP6B的載體的構(gòu)建將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳跑膠檢測表明目的片段均已克隆出來（圖2.2A和B）。將目的片段切膠回收后由上海生工生物公司測序后經(jīng)比對確認擴增片段為構(gòu)建載體所需要的片段。將目的片段與載體連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，提質(zhì)粒后分別用 KpnⅠ/EcoRⅠ和 PstⅠ/KpnⅠ酶切驗證鑒定陽性克隆，驗證正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌保存，即獲得用于VIGS 系統(tǒng)中沉默GaTOP6B的pTRV2-GaTOP6B重 組 質(zhì) 粒 和 用 于 構(gòu) 建 超 表 達 GaTOP6B 轉(zhuǎn) 基 因 擬 南 芥 的pCAMBIA1300-GaTOP6B 重組質(zhì)粒。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 田又升;王志軍;于航;董永梅;張國麗;馬盼盼;謝宗銘;;干旱脅迫對不同抗旱性棉花品種抗氧化酶活性及基因表達的影響[J];西北植物學(xué)報;2015年12期

2 王婭玲;李維峰;;干旱脅迫對植物生長及其生理的影響概述[J];南方農(nóng)業(yè);2015年06期

3 王玉玨;付秋實;鄭禾;溫常龍;程琳;趙冰;郭仰東;;干旱脅迫對黃瓜幼苗生長、光合生理及氣孔特征的影響[J];中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2010年05期

4 張雪妍;劉傳亮;王俊娟;李付廣;葉武威;;PEG脅迫方法評價棉花幼苗耐旱性研究[J];棉花學(xué)報;2007年03期

本文編號：2764590