【摘要】：小麥條銹病是由小麥條銹菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的一種重要真菌病害,對(duì)我國(guó)小麥生產(chǎn)帶來(lái)重要威脅。與化學(xué)防控相比,利用抗病基因及選育抗病品種是控制小麥條銹病最為經(jīng)濟(jì)、有效的途徑。小麥抗條銹病基因Yr10是一個(gè)全生育期抗病基因(ASR),對(duì)我國(guó)目前主要小麥條銹菌流行小種提供高水平抗病性,是一個(gè)優(yōu)良的抗病性基因。為克隆Yr10基因,本研究對(duì)已報(bào)道的Yr10候選基因(Yr10_(CG),GenBank ID AF149112)進(jìn)行了驗(yàn)證,并開展了Yr10基因的遺傳作圖。研究表明Yr10_(CG)基因并不代表真正的Yr10抗病位點(diǎn),二者相距1.2 cM。主要結(jié)果如下:1、Yr10基因提供相對(duì)穩(wěn)定的小麥條銹菌抗病性。通過(guò)多年試驗(yàn),攜帶Yr10基因的材料在黃淮麥區(qū)一直表現(xiàn)高水平抗病性。Yr10單基因的抗病表現(xiàn)與其供體材料‘Moro’不同:Moro呈現(xiàn)免疫反應(yīng),而攜帶Yr10單基因的植株葉片常呈現(xiàn)壞死條紋或壞死斑,但壞死組織通常沒(méi)有條銹菌孢子堆的出現(xiàn),抗病反應(yīng)型IT=1-3,構(gòu)成Yr10基因的特征表型。2、Yr10_(CG)基因與小麥抗條銹病表型缺乏緊密聯(lián)鎖關(guān)系。通過(guò)利用Yr10_(CG)特異引物篩選種質(zhì)材料并進(jìn)行表型關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)攜帶Yr10_(CG)基因的62份小麥并非都表現(xiàn)抗條銹病,其中11份材料表現(xiàn)中感,4份材料表現(xiàn)高感小麥條銹病。為此,我們利用Ubi和WKS1兩種啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)Yr10_(CG)基因開展轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn),利用條銹菌小種‘條中29’進(jìn)行接種驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)Yr10_(CG)基因的表達(dá)并不能提高轉(zhuǎn)基因‘Bobwhite’植株的抗條銹病水平。3、Yr10位于Yr10_(CG)基因遠(yuǎn)著絲粒端約1.2 cM。利用Yr10基因的供體材料Moro(含有兩個(gè)顯性抗條銹病基因)與高感小麥條銹病材料‘輝縣紅’進(jìn)行雜交,獲得Yr10單基因分離的F_(2:3)群體(pop8、pop10)并開展初步遺傳定位。挑選pop8和pop10中表現(xiàn)抗感分離的株系,發(fā)展成為精細(xì)定位群體,利用其中1,726個(gè)感病單株(pop11)進(jìn)行基因的精確定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Yr10_(CG)并不代表Yr10位點(diǎn),Yr10_(CG)基因位于Yr10位點(diǎn)近著絲粒端約1.2 cM的位置。我們另外開發(fā)了與Yr10位點(diǎn)緊密連鎖的標(biāo)記Xsdauw79。4、利用合成小麥創(chuàng)建Yr10基因的高效定位群體。普通小麥之間遺傳多態(tài)性較低,為Yr10基因的進(jìn)一步定位帶來(lái)了難度。我們選擇了6個(gè)人工合成小麥材料,分別與pop8、pop10群體中Yr10位點(diǎn)純合的抗病單株雜交重新構(gòu)建作圖群體,獲得了11個(gè)雜交組合,并對(duì)其中4個(gè)群體開展了抗條銹病表型鑒定和遺傳分析,結(jié)果符合單基因分離模式。根據(jù)小麥基因組參考序列開發(fā)了標(biāo)記,并在新型作圖群體上進(jìn)行Yr10基因的定位。但是,該區(qū)域的標(biāo)記多為顯性標(biāo)記,只在人工合成小麥材料工作,由此推測(cè)小麥1BS染色體末端存在結(jié)構(gòu)變異。5、Yr10基因區(qū)域存在明顯的染色體結(jié)構(gòu)變異。我們比較了六倍體小麥‘Chinese Spring’和四倍體小麥‘Zavitan’1BS染色體末端2.5 Mb范圍內(nèi)的染色體序列,發(fā)現(xiàn)存在明顯的染色體結(jié)構(gòu)變異。六倍體小麥末端1.5 Mb范圍內(nèi)的11個(gè)基因在四倍體小麥中沒(méi)有同源基因,兩個(gè)小麥材料在1BS末端存在一個(gè)約1 Mb的染色體倒位。Yr10基因正位于這個(gè)倒位區(qū)間。6、Yr10基因突變?nèi)后w的建立。為獲得Yr10基因并驗(yàn)證其基因功能,我們利用1%和1.05%EMS共處理了10,000粒Yr10單基因純合的種子,獲得M_1突變植株2,100株。經(jīng)接種鑒定及分子標(biāo)記輔助篩選,共獲得8個(gè)獨(dú)立突變體株系,表現(xiàn)高感小麥條銹病,將用于Yr10候選基因的挖掘和功能驗(yàn)證。本研究對(duì)前人報(bào)道的Yr10候選基因(Yr10_(CG),Genbank ID AF149112)進(jìn)行了驗(yàn)證,并開展了Yr10基因的遺傳作圖。研究發(fā)現(xiàn)Yr10_(CG)基因并不代表Yr10位點(diǎn),二者相距1.2 cM。我們近一步開發(fā)了與Yr10基因緊密連鎖的標(biāo)記Xsdauw79。Yr10基因提供全生育期抗病性,Yr10基因的準(zhǔn)確定位將為小麥抗病育種和該基因的克隆奠定了良好的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.121.42
【圖文】：

的供體材料是普通小麥 Moro，前人研究發(fā)現(xiàn) Moro 中含有兩個(gè)條銹病10 和 YrMor（Chen, 2005）。本課題組通過(guò)多年多點(diǎn)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) Moro 對(duì)高抗接近免疫（IT=0）。從 Moro/輝縣紅 F2群體中獲得了 Yr10 單基因 pop8、pop10，其中攜帶 Yr10 單基因的植株也表現(xiàn)對(duì)小麥條銹菌的高=1-2）。 Yr10 單基因的材料其抗病反應(yīng)型明顯不同于 Moro（攜帶雙抗病基因）因的抗病植株葉片呈現(xiàn)細(xì)小的壞死條紋或點(diǎn)狀壞死斑，但是壞死組織部銹菌孢子堆，抗病反應(yīng)型 IT=1-3，構(gòu)成 Yr10 基因的特征表型（圖 2）。從四川的抗病測(cè)試中，Moro 與 Yr10 單基因材料逐漸失去了對(duì)條銹菌的抗川地區(qū)已經(jīng)有新的毒性小種開始流行，導(dǎo)致 Yr10 基因抗病性有所喪失山東泰安）的小麥抗條銹病測(cè)試中（2011-2018 年間），Yr10 基因依然菌的高水平抗病性。

圖 3 Yr10CG位點(diǎn)與小麥抗條銹病性狀的關(guān)聯(lián)分析A：親本材料；B：免疫材料；C：高抗材料；D：中抗材料；E：中感材料；F：高感材料Fig. 3 Stripe rust responses of Yr10CG-positive genotypes.A. Parental lines used for the Yr10 gene mapping. B F. Resistance spectrum of the Yr10CG-positive germplasm..2.2 Yr10CG的轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證為進(jìn)一步驗(yàn)證 Yr10CG基因功能，我們從 Moro 中克隆到 Yr10CG基因的全長(zhǎng) cDNA，后利用 gateway 技術(shù)構(gòu)建了 Yr10CG基因的 2 個(gè)表達(dá)載體。載體 1 中玉米泛素啟動(dòng)子驅(qū) Yr10CGcDNA 的表達(dá)，載體 2 中小麥抗條銹病基因 WKS1 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) Yr10CGcDNA表達(dá)，并且兩個(gè)載體都攜帶抗除草劑 Bar 基因篩選標(biāo)記。利用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)，分別化普通小麥‘Bobwhite’幼胚 1,100 個(gè)（Ubi:: Yr10CG-cDNA）和 1,800 個(gè)（WKS1::r10CG-cDNA），通過(guò) PCR 標(biāo)記和除草劑檢測(cè)，載體 1 獲得 4 個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系共

小麥抗條銹病基因 Yr10 的遺傳分析17 個(gè)陽(yáng)性植株，載體 2 獲得 5 個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系共 11 個(gè)陽(yáng)性植株。T0轉(zhuǎn)基因植株自交獲得 T1代種子。我們針對(duì) 2 個(gè)載體分別選取 1 個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系，每個(gè)株系包括 2 棵陽(yáng)性植株和 2 棵陰性植株開展抗條銹病測(cè)試（針對(duì) CYR29 單一小種），并檢測(cè)了 Yr10CG在基因組水平的呈現(xiàn)和 cDNA 水平的表達(dá)；相關(guān)檢測(cè)也涉及Moro（+Yr10）、Bobwhite（-Yr10）、pop8 群體的抗病株系 pop8-10（+Yr10）、pop1群體的抗病株系（+Yr10）等對(duì)照植株（圖 4）。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系中的陽(yáng)性植株和陰性植株條銹菌接種反應(yīng)與轉(zhuǎn)基因受體材料 Bobwhite 類似，都不表現(xiàn)抗病，葉片表面有明顯孢子堆堆積（IT=6-7）。然而，Yr10 基因的供體材料 Moro 以及 Yr10 單基因陽(yáng)性個(gè)體均表現(xiàn)高水平抗�。▓D 4）。結(jié)果說(shuō)明，Yr10CG的轉(zhuǎn)基因表達(dá)并不能提高受體材料的抗條銹病水平。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃沖;姜玉英;紀(jì)國(guó)強(qiáng);張國(guó)芝;李輝;李亞紅;;2017年我國(guó)小麥條銹病流行大尺度時(shí)空動(dòng)態(tài)分析[J];植物保護(hù)學(xué)報(bào);2018年01期

本文編號(hào)：2764500