【摘要】：小麥條銹病是由小麥條銹菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的一種重要真菌病害,對我國小麥生產(chǎn)帶來重要威脅。與化學防控相比,利用抗病基因及選育抗病品種是控制小麥條銹病最為經(jīng)濟、有效的途徑。小麥抗條銹病基因Yr10是一個全生育期抗病基因(ASR),對我國目前主要小麥條銹菌流行小種提供高水平抗病性,是一個優(yōu)良的抗病性基因。為克隆Yr10基因,本研究對已報道的Yr10候選基因(Yr10_(CG),GenBank ID AF149112)進行了驗證,并開展了Yr10基因的遺傳作圖。研究表明Yr10_(CG)基因并不代表真正的Yr10抗病位點,二者相距1.2 cM。主要結(jié)果如下:1、Yr10基因提供相對穩(wěn)定的小麥條銹菌抗病性。通過多年試驗,攜帶Yr10基因的材料在黃淮麥區(qū)一直表現(xiàn)高水平抗病性。Yr10單基因的抗病表現(xiàn)與其供體材料‘Moro’不同:Moro呈現(xiàn)免疫反應,而攜帶Yr10單基因的植株葉片常呈現(xiàn)壞死條紋或壞死斑,但壞死組織通常沒有條銹菌孢子堆的出現(xiàn),抗病反應型IT=1-3,構(gòu)成Yr10基因的特征表型。2、Yr10_(CG)基因與小麥抗條銹病表型缺乏緊密聯(lián)鎖關(guān)系。通過利用Yr10_(CG)特異引物篩選種質(zhì)材料并進行表型關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)攜帶Yr10_(CG)基因的62份小麥并非都表現(xiàn)抗條銹病,其中11份材料表現(xiàn)中感,4份材料表現(xiàn)高感小麥條銹病。為此,我們利用Ubi和WKS1兩種啟動子分別驅(qū)動Yr10_(CG)基因開展轉(zhuǎn)基因互補實驗,利用條銹菌小種‘條中29’進行接種驗證,發(fā)現(xiàn)Yr10_(CG)基因的表達并不能提高轉(zhuǎn)基因‘Bobwhite’植株的抗條銹病水平。3、Yr10位于Yr10_(CG)基因遠著絲粒端約1.2 cM。利用Yr10基因的供體材料Moro(含有兩個顯性抗條銹病基因)與高感小麥條銹病材料‘輝縣紅’進行雜交,獲得Yr10單基因分離的F_(2:3)群體(pop8、pop10)并開展初步遺傳定位。挑選pop8和pop10中表現(xiàn)抗感分離的株系,發(fā)展成為精細定位群體,利用其中1,726個感病單株(pop11)進行基因的精確定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Yr10_(CG)并不代表Yr10位點,Yr10_(CG)基因位于Yr10位點近著絲粒端約1.2 cM的位置。我們另外開發(fā)了與Yr10位點緊密連鎖的標記Xsdauw79。4、利用合成小麥創(chuàng)建Yr10基因的高效定位群體。普通小麥之間遺傳多態(tài)性較低,為Yr10基因的進一步定位帶來了難度。我們選擇了6個人工合成小麥材料,分別與pop8、pop10群體中Yr10位點純合的抗病單株雜交重新構(gòu)建作圖群體,獲得了11個雜交組合,并對其中4個群體開展了抗條銹病表型鑒定和遺傳分析,結(jié)果符合單基因分離模式。根據(jù)小麥基因組參考序列開發(fā)了標記,并在新型作圖群體上進行Yr10基因的定位。但是,該區(qū)域的標記多為顯性標記,只在人工合成小麥材料工作,由此推測小麥1BS染色體末端存在結(jié)構(gòu)變異。5、Yr10基因區(qū)域存在明顯的染色體結(jié)構(gòu)變異。我們比較了六倍體小麥‘Chinese Spring’和四倍體小麥‘Zavitan’1BS染色體末端2.5 Mb范圍內(nèi)的染色體序列,發(fā)現(xiàn)存在明顯的染色體結(jié)構(gòu)變異。六倍體小麥末端1.5 Mb范圍內(nèi)的11個基因在四倍體小麥中沒有同源基因,兩個小麥材料在1BS末端存在一個約1 Mb的染色體倒位。Yr10基因正位于這個倒位區(qū)間。6、Yr10基因突變?nèi)后w的建立。為獲得Yr10基因并驗證其基因功能,我們利用1%和1.05%EMS共處理了10,000粒Yr10單基因純合的種子,獲得M_1突變植株2,100株。經(jīng)接種鑒定及分子標記輔助篩選,共獲得8個獨立突變體株系,表現(xiàn)高感小麥條銹病,將用于Yr10候選基因的挖掘和功能驗證。本研究對前人報道的Yr10候選基因(Yr10_(CG),Genbank ID AF149112)進行了驗證,并開展了Yr10基因的遺傳作圖。研究發(fā)現(xiàn)Yr10_(CG)基因并不代表Yr10位點,二者相距1.2 cM。我們近一步開發(fā)了與Yr10基因緊密連鎖的標記Xsdauw79。Yr10基因提供全生育期抗病性,Yr10基因的準確定位將為小麥抗病育種和該基因的克隆奠定了良好的基礎。
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S435.121.42
【圖文】：

的供體材料是普通小麥 Moro，前人研究發(fā)現(xiàn) Moro 中含有兩個條銹病10 和 YrMor（Chen, 2005）。本課題組通過多年多點試驗，發(fā)現(xiàn) Moro 對高抗接近免疫（IT=0）。從 Moro/輝縣紅 F2群體中獲得了 Yr10 單基因 pop8、pop10，其中攜帶 Yr10 單基因的植株也表現(xiàn)對小麥條銹菌的高=1-2）。 Yr10 單基因的材料其抗病反應型明顯不同于 Moro（攜帶雙抗病基因）因的抗病植株葉片呈現(xiàn)細小的壞死條紋或點狀壞死斑，但是壞死組織部銹菌孢子堆，抗病反應型 IT=1-3，構(gòu)成 Yr10 基因的特征表型（圖 2）。從四川的抗病測試中，Moro 與 Yr10 單基因材料逐漸失去了對條銹菌的抗川地區(qū)已經(jīng)有新的毒性小種開始流行，導致 Yr10 基因抗病性有所喪失山東泰安）的小麥抗條銹病測試中（2011-2018 年間），Yr10 基因依然菌的高水平抗病性。

圖 3 Yr10CG位點與小麥抗條銹病性狀的關(guān)聯(lián)分析A：親本材料；B：免疫材料；C：高抗材料；D：中抗材料；E：中感材料；F：高感材料Fig. 3 Stripe rust responses of Yr10CG-positive genotypes.A. Parental lines used for the Yr10 gene mapping. B F. Resistance spectrum of the Yr10CG-positive germplasm..2.2 Yr10CG的轉(zhuǎn)基因功能驗證為進一步驗證 Yr10CG基因功能，我們從 Moro 中克隆到 Yr10CG基因的全長 cDNA，后利用 gateway 技術(shù)構(gòu)建了 Yr10CG基因的 2 個表達載體。載體 1 中玉米泛素啟動子驅(qū) Yr10CGcDNA 的表達，載體 2 中小麥抗條銹病基因 WKS1 啟動子驅(qū)動 Yr10CGcDNA表達，并且兩個載體都攜帶抗除草劑 Bar 基因篩選標記。利用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)，分別化普通小麥‘Bobwhite’幼胚 1,100 個（Ubi:: Yr10CG-cDNA）和 1,800 個（WKS1::r10CG-cDNA），通過 PCR 標記和除草劑檢測，載體 1 獲得 4 個獨立的轉(zhuǎn)基因株系共

小麥抗條銹病基因 Yr10 的遺傳分析17 個陽性植株，載體 2 獲得 5 個獨立的轉(zhuǎn)基因株系共 11 個陽性植株。T0轉(zhuǎn)基因植株自交獲得 T1代種子。我們針對 2 個載體分別選取 1 個獨立的轉(zhuǎn)基因株系，每個株系包括 2 棵陽性植株和 2 棵陰性植株開展抗條銹病測試（針對 CYR29 單一小種），并檢測了 Yr10CG在基因組水平的呈現(xiàn)和 cDNA 水平的表達；相關(guān)檢測也涉及Moro（+Yr10）、Bobwhite（-Yr10）、pop8 群體的抗病株系 pop8-10（+Yr10）、pop1群體的抗病株系（+Yr10）等對照植株（圖 4）。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系中的陽性植株和陰性植株條銹菌接種反應與轉(zhuǎn)基因受體材料 Bobwhite 類似，都不表現(xiàn)抗病，葉片表面有明顯孢子堆堆積（IT=6-7）。然而，Yr10 基因的供體材料 Moro 以及 Yr10 單基因陽性個體均表現(xiàn)高水平抗�。▓D 4）。結(jié)果說明，Yr10CG的轉(zhuǎn)基因表達并不能提高受體材料的抗條銹病水平。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃沖;姜玉英;紀國強;張國芝;李輝;李亞紅;;2017年我國小麥條銹病流行大尺度時空動態(tài)分析[J];植物保護學報;2018年01期

本文編號：2764500