【摘要】：第一部分基于二代測序的中國人群急性髓系白血病基因突變模式及生物信息學分析研究背景急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是起源于髓系造血祖細胞的異質性惡性克隆性疾病,以骨髓和外周血中髓系原始細胞大量克隆增殖、抑制正常骨髓造血為特點。時至今日,化療仍是治療該病的主要手段,幾十年來尚未取得重大突破。但是不同患者的臨床病程和預后不同,對化療的反應也不同。已有許多研究揭示了分子異常在AML中的作用和影響,并提出了精準醫(yī)療和個體化醫(yī)療的概念。目前,一些AML中常見的基因異常如FLT3內部串聯重復(FLT3-ITD)已被加入危險度分層和預后判斷的評價體系。在二代測序技術大規(guī)模應用的時代,研究基因突變及其在疾病中所起的作用對發(fā)展精準醫(yī)療和個體化醫(yī)療具有重要臨床意義。目前已有多篇報道揭示了 AML患者中的重現性基因突變異常,一些被證明提示預后良好,一些被證明提示預后不良。然而更多關于體細胞突變與臨床特征之間的關系及內在機制仍待深入研究。此外,中國人群AML患者的基因突變模式鮮見報道。研究目的為了向AML診斷和治療提供更多信息和證據,對78例中國人群AML患者進行NCCN指南推薦的22個AML/MDS相關基因的靶向二代測序,旨在揭示基因型-表型演化關系,為精準醫(yī)療和個性化治療提供理論依據和新藥開發(fā)方向。研究方法1.患者標本78例于2016年2月至2017年10月期間在山東大學齊魯醫(yī)院接受治療并做了二代測序基因突變檢測的初診和隨訪AML患者被納入研究。根據法-美-英(FAB)分型,患者被劃分為M1、M2、M3、M4、M5、M6和未分類。所有患者均已簽署知情同意書。2.標本處理收集78例AML患者的骨髓標本,經過紅細胞裂解液處理獲得單個核細胞,使用天根基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。3.二代測序靶向22個基因的二代測序委托上海源奇公司借助Illumina公司HiSeq系統(tǒng)實施,平均測序深度2000×。文庫由至少10μg基因組DNA構建。后續(xù)的序列拼接比對參考人類參考基因組GRCh37。該22個基因來自2015年NCCN指南推薦的MDS和AML相關基因突變。4.Sanger 測序通過二代測序發(fā)現的一些未報道的體細胞突變委托鉑尚生物技術公司進行Sanger測序檢驗。針對突變區(qū)域設計特異性測序引物,然后進行聚合酶鏈式反應(PCR)。對PCR產物的一代測序由ABI PRISM 3730x1遺傳分析儀器完成。后續(xù)基因序列可視化過程在SnapGene Viewer 3.2軟件中進行。5.數據分析數據分析借助SPSS24.0軟件完成。非正態(tài)分布的連續(xù)型變量由中位數(四分位數間距)表示。兩組呈正態(tài)分布的的連續(xù)型變量的均值由獨立樣本t檢驗比較。非正態(tài)變量由非參數檢驗進行比較。對四格表資料由卡方檢驗或Fisher確切概率檢驗進行比較。單因素和多因素分析由線性回歸和邏輯回歸完成。生存分析做Kaplan-Meier分析和Cox回歸分析。p值小于0.05認為有意義。6.生物信息學分析借助 mutationtaster、PolyPhen2、mutationassessor 和 SIFT 軟件預測新發(fā)現的PHF6 H302R點突變對蛋白和疾病的影響。利用cBioportal在線軟件制作基因突變模式圖。利用cBioportal和UALCAN在線軟件對TCGA公開的AML數據進行計算和圖形繪制。基因突變和藥物敏感性之間的關系通過檢索查詢GDSC數據庫進行預測。研究結果1.中國人群AML患者基因突變譜特征78例AML患者平均年齡53歲,男性占56%,其中62例(80%)患者至少存在一個基因突變,突變頻數為1-6。FLT3突變頻率為26%,NRAS 17%,NPM115%,DNMT3A 和 IDH214%,ASXL112%,KIT、IDH1、TET2 和 U2AF19%,CEBPA 和 SRSF2 6%,EZH2 和 SF3B1 4%,TP53、SETBP1 和 ETV6 3%,RUNX1、PHF6、CBL和JAK2 1%。ZRSR2編碼區(qū)未發(fā)現突變。檢測到的突變包括點突變、插入/缺失突變,多數突變傾向發(fā)生于蛋白質結構重要結構域中。2.基因突變與臨床和實驗室指標之間的關系以60歲為分界線將患者劃分為老年患者(60歲)和中青年患者(60歲),Fisher確切概率檢驗提示SRSF2突變與老年相關。在單因素分析中,伴有FLT3突變的患者顯示出更高的骨髓原始細胞數、外周血原始細胞數、流式異常細胞比例和白細胞數。伴有TET2突變的患者顯示出更高的外周血原始細胞數。在外周血原始細胞數和白細胞數的多因素分析中,FLT3和TET2都是危險因素。另外,TET2突變與首次化療后未緩解(NR)相關。盡管伴有SRSF2突變的患者首次化療后均為NR,但沒有統(tǒng)計學差異。3.基因突變對臨床預后的影響伴有三種或以上突變的患者總生存期較伴有少于三種突變的患者短。伴有表觀調節(jié)基因(DNMT3A、TET2、ASXL1、IDH1/2、EZH2)突變的患者比不伴有這些突變的患者生存期短。伴有IDH1/2突變的患者比不伴有這些突變的患者生存期短。對全部AML人群,多因素分析顯示FLT3-ITD、DNMT3A、IDH1、TET2和SRSF2突變是危險因素。對非M3患者,多因素分析顯示FLT3-ITD、DNMT3A、IDH1和SRSF2突變是危險因素。對老年AML患者,多因素分析顯示FLT3-ITD、DNMT3A和IDH1突變是危險因素。對細胞遺傳學正常的AML患者,多因素分析顯示FLT3-ITD、DNMT3A和IDH突變是危險因素。4.一代測序驗證的新發(fā)現突變通過二代測序發(fā)現了 cosmic數據庫和文獻中未報道過的15種新突變,包括1種點突變PHF6H302R和14種插入/缺失突變。對其中6例插入/缺失突變標本進行Sanger測序驗證,有5例檢測到移碼,有1例可能由于等位基因變異頻率低(5.47%),低于Sanger測序檢測閾值,因此未檢測到移碼。使用mutationtaster、PolyPhen2、mutationassessor和SIFT軟件預測PHF6H302R點突變對蛋白和疾病的影響,結果均為致病/損害大/影響大/影響蛋白功能。5.中國人群AML和白種人突變模式的比較通過計算分析TCGA公開的白種人AML基因突變數據,發(fā)現基因突變譜與中國人群AML相似,但NRAS、ASXL1、SRSF2突變率較中國人群低,NPM1、DNMT3A、RUNX1突變率較中國人群高。6.基因突變與藥物敏感性的關系通過檢索GDSC數據庫發(fā)現伴有個別基因突變的AML細胞系對一些藥物或小分子化合物具有更高或更低的敏感性。結論1.80%患者至少存在一個基因突變,而其中近半數為只含一個突變。2.FLT3突變與TET2突變與外周血原始細胞數和白細胞數相關。3.TET2突變與第一周期化療效果相關。4.FLT3-ITD、DNMT3A、IDH1、TET2和SRSF2突變是總生存期的危險因素。5.發(fā)現了 15個新突變類型。6.總結了白種人AML突變特征,并與中國人群AML突變特征進行了比較。7.總結了基因突變與藥物敏感性之間的關系。第二部分Irf8在急性T淋巴細胞白血病中的作用和機制研究研究背景急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)是由基因突變引起的T系前體細胞惡性轉化導致的造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病。近年來,隨著T-ALL治療的進展,多數患者可獲得完全緩解,但復發(fā)率仍然很高,長期生存率僅25-50%。因此,深入研究T-ALL的發(fā)病機制,尋找新的靶向治療策略,不僅具有重要的科學意義,更具有潛在的臨床應用價值。很多研究表明,Notch1突變是公認的T-ALL致病突變之一。Notch1是進化保守的內皮生長因子樣跨膜受體蛋白(Notch)家族成員,其信號轉導與細胞增殖、分化和凋亡密切相關。2004年有文獻首次報道,超過50%的兒童及成人T-ALL患者存在Notch1激活突變現象,此后Notch1逐漸成為公認的T-ALL致癌基因。在淋巴細胞形成過程中,Notch1可促進T細胞的分化而抑制B細胞的分化,在T細胞形成與發(fā)展的多個階段發(fā)揮作用。研究表明,選擇性失活的Notch1信號通路可使T細胞增殖分化停滯,而Notch1基因突變可導致下游信號的持續(xù)激活,繼而促進T-ALL的發(fā)生。關于白血病發(fā)生機制的“二次打擊”學說認為,僅Notch1激活突變不足以導致白血病,仍需其他分子協(xié)同作用,共同導致T-ALL發(fā)生。干擾素調節(jié)因子8(Irf8)是干擾素調節(jié)因子家族中的一個轉錄因子,在調節(jié)造血系統(tǒng)譜系分化方面起重要作用。研究表明,Irf8促進粒系和B系細胞分化,而抑制單核-巨噬系和T系細胞分化。有報道顯示,Irf8在髓系白血病中表達降低;在急性髓系白血病(AML)中發(fā)生剪接突變,野生型和突變型Irf8轉錄本表達增加與無復發(fā)生存率降低相關。還有報道顯示Irf8在B系淋巴瘤不同亞型中存在表達差異,可作為一種新的診斷標志物。此外,多項研究顯示,Irf8在鼻咽癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、腎癌等多種癌癥或其他疾病中發(fā)現甲基化水平改變,證明其本身是抑癌基因,由于異常甲基化導致其表達水平下調,起到致癌作用。另有報道,在調節(jié)性樹突細胞中,Notch-RBP-J信號通路可通過MLL和PRC2等分子介導的組蛋白甲基化修飾使Irf8處于染色質折疊狀態(tài),抑制其表達水平。而在巨噬細胞中,RBP-J可促進Irf8蛋白合成。研究Irf8在T-ALL中的甲基化和基因表達水平及分子功能,有助于揭示Irf8和Notch1在T-ALL發(fā)生發(fā)展中的相互作用和機制,為T-ALL的診治提供新思路。本研究發(fā)現,Ir8敲除小鼠的骨髓單個核細胞高表達Yes相關蛋白(YAP)分子。YAP是Hippo通路的重要成員,該通路參與器官發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和再生等重要生理過程。最近的研究表明,YAP作為一種癌蛋白,對大多數實體瘤的發(fā)生或生長至關重要,它的激活誘導癌癥干細胞的特性維持、增殖、化療耐藥性和轉移。而在白血病中,有報道顯示,YAP在慢性髓性白血病(CML)細胞中過表達,抑制YAP的功能能夠抑制CML細胞增殖,促進其凋亡。此外,YAP抑制劑維替泊芬可在體外增強伊馬替尼的功效并抑制體內白血病的發(fā)生。但YAP在T-ALL中的表達水平和功能鮮見報道。由此提出科學假設:在共同淋系祖細胞水平由于Irf8異常甲基化導致其mRNA表達水平下調,進而抑制B系分化,促進T系細胞產生,協(xié)同Notch1使CLP轉化為白血病起始細胞,并通過下游分子YAP促進白血病細胞干性維持或促進耐藥,加速T-ALL發(fā)生和發(fā)展。研究目的研究Irf8協(xié)同Notch1激活促進T-ALL發(fā)生發(fā)展的作用及分子機制。研究方法1.生物信息學分析檢索并計算分析oncomine數據庫公開的T-ALL芯片數據,比較T-ALL患者與健康對照Irf8基因表達水平差異。利用MethPrimer在線網站分析Irf8啟動子區(qū)域,預測CpG島密集程度。2.細胞培養(yǎng)293T細胞系使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。病毒包裝前一晚將狀態(tài)良好的293T細胞按8×106-1×107/皿鋪種直徑10cm細胞培養(yǎng)皿。小鼠lin-細胞使用含15%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)。CCRF-CEM細胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。293T細胞使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。3.MSCV-Notch1-IRES-GFP 病毒包裝擴增 MSCV-Notch1-IRES-GFP、pKat、VSVG 菌液,提取三種質粒,按照 7:5:3比例轉染已鋪皿的293T細胞,8h后換新鮮培養(yǎng)基,轉染48h和72h分別收集培養(yǎng)基上清,經0.45μm濾器過濾,即為含MSCV-Notch1-IRES-GFP病毒顆粒的病毒液。4.體內驗證敲除Irf8協(xié)同Notch1激活促進T-ALL發(fā)生發(fā)展常規(guī)飼養(yǎng)Irf8-/-和WT小鼠。提取Irf8-/-和WT小鼠骨髓細胞,lineage磁珠分選骨髓造血干/祖細胞(lin-細胞),加TPO、FLT3、SCF細胞因子過夜預刺激后加入MSCV-Notch1-IRES-GFP逆轉錄病毒液培養(yǎng),8h后更換新鮮培養(yǎng)基,48h后熒光顯微鏡下觀察熒光,流式檢測GFP細胞比例,尾靜脈注射經致死劑量照射的C57BL/6J小鼠,8周后小鼠逐漸發(fā)病。檢測發(fā)病小鼠白血病相關指標,繪制生存曲線,驗證敲除Irf8協(xié)同Notch1激活促進T-ALL發(fā)生發(fā)展。5.構建MSCV-Irf8-IRES-GFP逆轉錄病毒真核表達載體及病毒包裝設計含有酶切位點的Irf8 CDS區(qū)特異性克隆引物,從含有Irf8 CDS區(qū)的普通質粒中克隆Irf8CDS區(qū),插入MSCV-IRES-GFP載體,構建MSCV-Ir8-IRES-GFP真核表達載體。病毒包裝過程同MSCV-Notch1-IRES-GFP。6.構建穩(wěn)定表達Irf8的T-ALL細胞株MSCV-Irf8-IRES-GFP病毒液感染CCRF-CEM細胞,擴增,流式分選GFP陽性的細胞,即為穩(wěn)定表達Irf8的CCRF-CEM細胞株。7.細胞增殖、周期及藥物誘導的凋亡檢測調整細胞密度種96孔板,CCK8法檢測CCRF-CEM-GFP和CCRF-CEM-Ir8增殖速率差異。PI單染法檢測細胞周期差異。AnnexinV-APC/7-AAD雙染法檢測藥物誘導的凋亡率差異。8.YAP表達量檢測收集Irf8-/-和WT小鼠骨髓單個核細胞、CCRF-CEM-GFP和CCRF-CEM-Irf8細胞,提取總RNA和總蛋白,RT-PCR和western blot檢測YAP mRNA和蛋白表達水平差異。研究結果1.T-ALL患者Irf8表達情況通過檢索oncomine數據庫公開的T-ALL芯片數據,發(fā)現在4項不同的研究芯片中,與健康對照相比,Irf8均顯示低表達。2.敲除Irf8協(xié)同Notch1突變促進T-ALL發(fā)生發(fā)展提取Irf8-8-和WT小鼠骨髓細胞,lineage磁珠分選骨髓造血干/祖細胞(lin-細胞),感染MSCV-Notch1-IRES-GFP逆轉錄病毒,尾靜脈注射經致死劑量照射的C57BL/6J小鼠,8周后小鼠逐漸發(fā)病,檢測到Irf8-/--Notch1小鼠較WT-Notch1小鼠生存期縮短,骨髓涂片和脾臟免疫組化顯示白血病細胞處于更原始階段,而兩組小鼠在發(fā)病時的外觀、血常規(guī)、體重增長率、脾臟大小無明顯差別。3.T-ALL細胞系中過表達Irf8阻滯細胞周期,促進凋亡CCK8檢測顯示,過表達Irf8的CCRF-CEM細胞增殖減慢,流式細胞術檢測顯示,過表達Irf8的細胞周期阻滯,藥物誘導的細胞凋亡增加,證明Irf8具有抑癌基因作用。4.Irf8負調控YAP通過檢索GEO數據庫公開的過表達或敲減Irf8芯片,篩選可能的下游靶基因。對Irf8-/-和WT小鼠骨髓單個核細胞進行western blot檢測,發(fā)現YAP在Irf8-/-小鼠中顯著高表達。而在CCRF-CEM-Irr8細胞中,PCR檢測到YAP低表達。結論1.r8在T-ALL中表達水平降低。2.過表達Irf8的T-ALL細胞系增殖減慢,細胞周期阻滯,藥物誘導的凋亡增加。3.I f8缺失能夠協(xié)同Notch1激活突變加速T-ALL發(fā)生發(fā)展4.Irf8負調控癌蛋白YAP。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R733.71
【圖文】：

圖２：邋７８例ＡＭＬ患者基因突變模式，包括總體突變率和每位患者突變類型。逡逑每一列代表一名患者，全灰色表示無突變，黑色方塊表示截短突變，紅色方塊逡逑表示開放閱讀框內不移碼突變，綠色方塊表示點突變。逡逑３４逡逑

圖３：邋２１個基因中突變發(fā)生的位置、類型和頻數。彩色色塊代表基因重要結構逡逑域，短棒所在的位置即基因突變發(fā)生的位置，短棒長短與左側標尺對比代表發(fā)逡逑生頻數。從中可看出，多數突變傾向發(fā)生于重要結構域。逡逑３５逡逑

圖.M甘.1胭婦自1閱陽目曲，

本文編號：2759680