基于人類全基因表達譜探討腎精虧虛證“異病同證”的分子機制

發(fā)布時間：2020-07-13 07:33

【摘要】：目的:1.理論研究:腎藏精藏象理論是中醫(yī)基礎(chǔ)理論的重要命題,通過梳理腎藏精理論發(fā)展的歷史源流,深刻認識腎藏精理論的歷史淵源。腎藏精是腎的主要生理功能,基于腎藏精理論探討“腎-骨-髓-腦”體系以及“腎精虧虛證”的理論基礎(chǔ)。2.實驗研究:通過人全基因組表達譜芯片高通量測序技術(shù),篩選“異病”(老年性癡呆和原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥)“同證”(腎精虧虛證)的差異表達基因,探討腎精虧虛證的分子生物學(xué)機制,驗證本研究的科學(xué)假說“腎精虧虛證的分子生物學(xué)機制可能與老年性疾病(原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和老年性癡呆)患者的人類全基因表達譜中差異表達的基因密切相關(guān)”,并探討性別不同因素對于“腎精虧虛證”老年性癡呆和原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者發(fā)病的影響,揭示“腎精虧虛”老年性疾病衰老機制的內(nèi)在規(guī)律,豐富“腎藏精”理論的基本科學(xué)內(nèi)涵。材料與方法:1.理論研究:通過閱讀中醫(yī)古籍,梳理“腎藏精”理論發(fā)展的歷史源流,深入探討“腎藏精主骨生髓”以及“腎精虧虛證”的理論基礎(chǔ)。2.實驗研究:(1)選擇符合納入標準的腎精虧虛證老年性癡呆組(AD group)16例、腎精虧虛證原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥組(OP group)16例、同年齡段健康狀態(tài)老年人對照組(control group)12例,三組均男女各半。(2)基于人全基因組表達譜芯片高通量測序技術(shù),采用Affymetrix公司的Prime View?Human Gene Expression Array基因表達譜芯片檢測三組人群外周血白細胞的基因表達譜。(3)通過比較腎精虧虛證AD組與對照組、腎精虧虛證OP組與對照組的基因表達譜,篩選差異表達的基因。(4)根據(jù)性別不同,分別比較男性和女性的腎精虧虛證AD組與相應(yīng)性別的對照組的基因表達譜,篩選差異表達的基因,并進一步比較同病同證不同性別患者差異基因表達的特征。(5)根據(jù)性別不同,分別比較男性和女性的腎精虧虛證OP組與相應(yīng)性別的對照組的基因表達譜,篩選差異表達的基因,并進一步比較同病同證不同性別患者差異基因表達的特征。(6)利用生物信息學(xué)方法,對篩選到的差異表達基因進行Gene Ontology(GO)功能富集分析和Pathway分析。(7)采用實時熒光定量PCR法(q RT-PCR)驗證差異性基因。(8)進一步分析“異病”(老年性癡呆和原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥)“同證”(腎精虧虛證)差異表達基因同源性。結(jié)果:1.“腎藏精”理論的歷史源流:先秦時期是“腎藏精”理論構(gòu)建形成的時期,秦漢南北朝時期是“腎藏精”理論傳承發(fā)揚的時期,唐宋金元時期是“腎藏精”理論進一步發(fā)展充實的時期,明清時期是“腎藏精”理論日趨成熟完善的時期,近現(xiàn)代時期是“腎藏精”理論繼承創(chuàng)新的時期。2.“腎藏精主骨生髓”理論是以腎所主形體為解剖形態(tài)基礎(chǔ),以精、天癸、元氣、津液等為生命物質(zhì)基礎(chǔ),以腎主蟄藏的生理特性為功能基礎(chǔ),以腎藏志為思維活動基礎(chǔ),以腎與膀胱、三焦、經(jīng)絡(luò)的聯(lián)系為人體整體觀基礎(chǔ),以腎與自然、社會的聯(lián)系為天人一體觀基礎(chǔ)而形成的復(fù)雜而獨特理論體系。3.“腎-骨-髓-腦”系統(tǒng)的建立是以“腎藏精主骨生髓”理論為基礎(chǔ),老年性癡呆和原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥均以“腎精虧虛”為根本病機,屬腎精虧虛證“異病同證”。4.腎精虧虛證老年性癡呆患者的差異表達基因:(1)與對照組比較,腎精虧虛證AD患者中特異性表達的探針有308個,對應(yīng)247個基因(FC≥1.5,q-value≤5%),其中上調(diào)基因228個,下調(diào)基因19個。上調(diào)倍數(shù)超過3倍的基因有6個,分別是S100P、SAMSN1、CCL4、TNFAIP3、SDCBP、IL1B,下調(diào)倍數(shù)小于0.5倍的基因有3個,分別是CX3CR1、EGR1、FOS。經(jīng)q RT-PCR驗證,上調(diào)表達的6個基因與對照組比,表達水平具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);下調(diào)表達的3個基因與對照組比,表達水平具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。(2)與對照組相應(yīng)的人群比較,女性腎精虧虛證AD患者共有323個差異性表達探針,對應(yīng)184個基因(FC≥1.5,q-value≤5%);男性腎精虧虛證AD患者只有33個探針呈現(xiàn)差異性,對應(yīng)27個基因(FC≥1.5,q-value≤5%),其中二者顯著共表達(FC≥3,q-value≤5%)的差異基因是:S100P(上調(diào))。5.腎精虧虛證原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者的差異表達基因:(1)與對照組比較,腎精虧虛證OP患者中特異性表達的探針有910個,對應(yīng)602個基因(FC≥1.5,q-value≤5%),其中上調(diào)基因579個,下調(diào)基因23個。上調(diào)倍數(shù)超過3倍的基因有7個,分別為S100P、SNX3、DEFA1、MMP9、LTF、ANXA3、IL1R2;下調(diào)倍數(shù)小于0.5倍的基因有3個,分別為CX3CR1、SPON2、GNLY。經(jīng)q RT-PCR驗證,上調(diào)表達的7個基因與對照組比,表達水平具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);下調(diào)表達的3個基因與對照組比,表達水平具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。(2)與對照組相應(yīng)的人群比較,女性腎精虧虛證OP患者共有182個差異性表達探針,對應(yīng)120個基因(FC≥1.5,q-value≤5%),男性腎精虧虛證OP患者共有138個差異性表達探針,對應(yīng)118個基因(FC≥1.5,q-value≤5%),其中二者顯著共表達(FC≥3,q-value≤5%)的差異基因是:SNX3(上調(diào))。6.“異病”(老年性癡呆和原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥)“同證”(腎精虧虛證)患者差異表達基因的同源性分析:與對照組比,腎精虧虛證OP和腎精虧虛證AD兩組患者呈現(xiàn)131個共表達的差異基因(FC≥1.5,q-value≤5%),其中顯著共表達的上調(diào)基因為S100P(FC≥3,q-value≤5%)、下調(diào)基因為CX3CR1(FC≥2,q-value≤5%)。男性、女性以及整個腎精虧虛證OP組患者分別與相應(yīng)的腎精虧虛證AD組患者比較所篩選的三組差異表達基因中,三組都呈現(xiàn)上調(diào)表達的差異基因僅為TNFSF10,都呈現(xiàn)下調(diào)表達的差異基因僅為CCL4/CCL4L1/CCL4L2(FC≥2,q-value≤5%)。結(jié)論:1.“腎藏精”藏象理論是中華民族在長期保養(yǎng)生命、維護健康、與疾病做斗爭的實踐過程形成的,經(jīng)過不斷傳承、發(fā)展、完善和創(chuàng)新,已成為獨具特色的理論體系�！澳I藏精主骨生髓”理論是“腎藏精”生理功能的重要組成部分。2.“腎-骨-髓-腦”系統(tǒng)的建立是以“腎藏精主骨生髓”理論為基礎(chǔ),老年性癡呆和原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥均以“腎精虧虛”為根本病機,屬腎精虧虛證“異病同證”。3.腎精虧虛證老年性癡呆患者呈現(xiàn)247個差異表達基因,其中顯著表達的差異基因依次是S100P、SAMSN1、CCL4、TNFAIP3、SDCBP、IL1B、CX3CR1、EGR1、FOS;腎精虧虛證原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者呈現(xiàn)602個差異表達基因,其中顯著表達的差異基因依次是S100P、SNX3、DEFA1、MMP9、LTF、ANXA3、IL1R2、CX3CR1、SPON2、GNLY。對于同病同證患者,性別因素對基因表達的影響顯而易見,提示體質(zhì)(性別不同)因素對于疾病的影響客觀存在。4.腎精虧虛證老年性癡呆和原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者呈現(xiàn)131個共表達的差異基因,其中顯著共表達的差異基因為S100P(上調(diào))、CX3CR1(下調(diào)),說明“腎精虧虛證”的老年性疾病(老年性癡呆和原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥)患者差異基因表達存在“個性”,同時也有“共性”,提示“腎精虧虛證”的分子生物學(xué)基礎(chǔ)與此“共性”有關(guān),而這一“共性”主要體現(xiàn)在干細胞及其微環(huán)境相關(guān)的基因表達異常。5.本研究提示我們:在臨床實踐中,對于“異病同證”不僅需要辨證求同,而且也需要辨病求異,并且要兼顧體質(zhì)等因素對疾病的影響,進一步為未來精準“病證結(jié)合論治”提供宏觀與微觀依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R223
【圖文】：

散點圖,差異表達基因,散點圖,對照組

基于人類全基因表達譜探討腎精虧虛證“異病同證”的分子機制實驗結(jié)果患者的差異表達基因，腎精虧虛證 AD 組中特異性表達的探針有 308 個ue≤5%），其中上調(diào)基因 228 個，下調(diào)基因 19 個腎精虧虛證 AD 組的表達明顯高于對照組（上調(diào)）的表達明顯低于對照組（下調(diào)）。對差異表達的很好的區(qū)分腎精虧虛證 AD 組和對照組（圖 2-1-2） 3 倍的基因有 6 個，分別為 S100P、SAMSN1、CCL42）；下調(diào)倍數(shù)小于 0.5 倍的基因有 3 個，分別為。

散點圖,差異表達基因,聚類分析,倍數(shù)