發(fā)布時(shí)間：2020-07-13 03:24

【摘要】：擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)是一種嚴(yán)重危害了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的腸道病原菌。由于口服疫苗接種不受魚(yú)體大小和養(yǎng)殖規(guī)模限制、易于操作,且誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的腸黏膜免疫在抗該菌感染中發(fā)揮著重要作用。因此,研制安全、高效和可用于口服免疫的擬態(tài)弧菌DNA疫苗顯得十分必要�？诜蚋刈⒚庖弋a(chǎn)生機(jī)制主要依賴腸黏膜免疫系統(tǒng)。盡管硬骨魚(yú)類腸黏膜免疫系統(tǒng)中缺乏如哺乳動(dòng)物的淋巴集結(jié)和樹(shù)突狀細(xì)胞,但在中后部腸段黏膜固有層中分布著大量免疫細(xì)胞。其中,腸巨噬細(xì)胞除具有呼吸爆發(fā)活性和吞噬殺傷功能外,還扮演著抗原遞呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cell,APC)角色,在先天性免疫和獲得性免疫之間發(fā)揮著橋梁作用。因此,魚(yú)類腸巨噬細(xì)胞的活性、功能以及抗原遞呈相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平是評(píng)價(jià)口服或肛注DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平,尤其是腸黏膜免疫水平的重要指標(biāo),同時(shí)國(guó)內(nèi)外關(guān)于魚(yú)類體外腸巨噬細(xì)胞的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中已構(gòu)建了擬態(tài)弧菌“裸”DNA疫苗,在此基礎(chǔ)上,本論文以大腸桿菌DH5α凍干菌影裝載“裸”DNA疫苗構(gòu)建靶向DNA疫苗,并檢測(cè)其對(duì)草魚(yú)腸巨噬細(xì)胞的活性、功能以及抗原遞呈相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。完成的主要研究工作和成果總結(jié)如下:1)大腸桿菌DH5α菌影的最佳裂解條件與裝載條件優(yōu)化。對(duì)初始濃度OD_(600nm)值分別為0.3、0.4、0.5和0.6的重組大腸桿菌DH5α(pBV220-LysisE)進(jìn)行42℃誘導(dǎo)溶菌,通過(guò)比較重組菌的溶菌動(dòng)力曲線、裂解效率及其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征,確定DH5α菌影最佳的裂解條件為選擇起始濃度OD_(600nm)為0.4的DH5α(pBV220-LysisE)菌液在42℃誘導(dǎo)2.5 h。在最佳裂解條件下大量制備DH5α凍干菌影,探討不同的凍干菌影、質(zhì)粒和膜囊比例對(duì)裝載量的影響,優(yōu)化出三者比例為5:3:1時(shí)裝載量最高。2)擬態(tài)弧菌靶向DNA疫苗的制備、免疫與轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測(cè)。在最佳裝載條件下以DH5α凍干菌影分別裝載真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Ovepis(擬態(tài)弧菌“裸”DNA疫苗)和pcDNA3.1-Iclp-Ovepis(擬態(tài)弧菌內(nèi)靶向DNA疫苗)制備出外靶向與雙靶向DNA疫苗。以擬態(tài)弧菌三種靶向DNA疫苗和“裸”DNA疫苗肛注免疫草魚(yú),經(jīng)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)疫苗基因于免疫后7、14和21 d在肝臟、頭腎、脾臟和腸組織中均有轉(zhuǎn)錄表達(dá)。3)免疫前后腸巨噬細(xì)胞的活性/功能及其抗原遞呈相關(guān)基因檢測(cè)。于免疫后7、14和21 d分離培養(yǎng)草魚(yú)腸巨噬細(xì)胞,分別采用NBT還原方法、Griess法、中性紅法檢測(cè)草魚(yú)腸巨噬細(xì)胞的氧呼吸爆發(fā)活性、氮呼吸爆發(fā)活性及吞噬能力。結(jié)果顯示,各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)雙靶向DNA疫苗組腸巨噬細(xì)胞的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)總體上優(yōu)于2個(gè)單靶向DNA疫苗組;免疫后7和14 d,2個(gè)單靶向DNA疫苗組腸巨噬細(xì)胞的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均優(yōu)于“裸”DNA疫苗組。此外,以熒光定量PCR方法檢測(cè)腸巨噬細(xì)胞中抗原遞呈相關(guān)基因(MHC-Iα、MHC-IIβ、Iclp、STING)轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)雙靶向DNA疫苗組腸巨噬細(xì)胞中MHC-Iα、MHC-IIβ和Iclp基因轉(zhuǎn)錄水平總體上高于單靶向DNA疫苗組和“裸”DNA疫苗組;四種DNA疫苗均能顯著提高腸巨噬細(xì)胞中STING基因的轉(zhuǎn)錄水平,但各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)組間差異無(wú)規(guī)律性。綜上所述,擬態(tài)弧菌三種靶向DNA疫苗均能顯著增強(qiáng)免疫草魚(yú)腸巨噬細(xì)胞的活性/功能及其抗原遞呈相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平,且總體上以雙靶向DNA疫苗的增強(qiáng)作用最好。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S941.42
【圖文】：

圖 1 MHC I 與 MHC II 類分子結(jié)構(gòu)圖 (引自張彥[25])Fig.1 Molecular structure of MHC I and MHC II ( Citing from ZhangYan[25])分子是一種異二聚體糖蛋白（由兩條α鏈和兩條β鏈組成），結(jié)構(gòu)如圖 1 右側(cè)。由 MHC IIα基因表達(dá)出α鏈和 MHC I

圖 2 Ii 鏈分子結(jié)構(gòu)圖（引自王巧巧[43]）Fig.2 Molecular structure of the Ii chain (Citing from WangQiaoqiao[43])作用質(zhì)網(wǎng)合成中，Ii 鏈合成數(shù)量是遠(yuǎn)大于 MHC II 類分子的。Gedde-Da

圖 3 Ii 鏈與 MHC II 類分子結(jié)合示意圖（引自王巧巧[43]）chematic diagram of binding of Ii chain to MHC class II molecules (Citing from WangQ定鏈類似蛋白的簡(jiǎn)介先是在斑馬魚(yú)體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)了魚(yú)類恒定鏈同源基因[47]，由于對(duì)其

【參考文獻(xiàn)】

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4 胡岸;吳婷;陳

本文編號(hào)：2752888