【摘要】：淡紫擬青霉(Purpureocillium lilacinum)是一種廣譜性很強(qiáng)的生防菌,其分泌的水解酶類(lèi)和次級(jí)代謝物對(duì)植物病蟲(chóng)害具有很好的防治作用。聚酮化合物是一種常見(jiàn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物,它是由聚酮化合物合成酶(PKS)催化乙酸、丙二酸或丁酸等脫羧縮合而成,根據(jù)PKS對(duì)β-keto基團(tuán)的還原程度,PKS被分為:非還原型聚酮合酶(NR-PKS)、部分還原型聚酮合酶(PR-PKS)及還原型聚酮合酶(HR-PKS),其中NR-PKS可以催化合成一環(huán)或多環(huán)的芳香型聚酮化合物。前期基因組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)淡紫擬青霉有4個(gè)NR-PKS基因,分別為VFPBJ_05021、VFPBJ_09342、VFPBJ_09755和VFPBJ_10843基因。Acremoxanthone C是由淡紫擬青霉所產(chǎn)的一種聚酮化合物,是氧雜蒽酮-蒽醌異二聚體,屬鈣調(diào)蛋白抑制劑,參與鈣離子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在新藥發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮重要作用。目前,關(guān)于Acremoxanthone C產(chǎn)生的分子生物學(xué)機(jī)制研究仍屬空白,基于此本研究以淡紫擬青霉北京(BJ)菌株為材料,對(duì)其RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并通過(guò)qPCR驗(yàn)證4個(gè)NR-PKS基因簇的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量,對(duì)VFPBJ_09756基因進(jìn)行超表達(dá),比較野生型和超表達(dá)菌株的產(chǎn)物。具體研究結(jié)果如下:對(duì)VFPBJ_05021、VFPBJ_09342、VFPBJ_09755和VFPBJ_10843基因簇的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并提取RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行qPCR驗(yàn)證這4個(gè)基因簇的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)。結(jié)果顯示VFPBJ_05021、VFPBJ_09342、VFPBJ_09755和VFPBJ_10843四個(gè)基因簇的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)趨勢(shì)與qPCR表達(dá)趨勢(shì)基本一致。VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因簇都有成簇共表達(dá)趨勢(shì),即簇內(nèi)基因表達(dá)量比簇外基因表達(dá)量相對(duì)較高。而VFPBJ_10843基因簇則相反,其簇內(nèi)基因表達(dá)量很低,尤其簇內(nèi)合成酶基因幾乎不表達(dá),但簇外基因卻有很高的表達(dá)量,故初步確定VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因簇可能為Acremoxanthone C的候選合成基因簇。對(duì)VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因進(jìn)行敲除載體構(gòu)建。VFPBJ_09342基因簇內(nèi)存在VFPBJ_11784轉(zhuǎn)錄因子,VFPBJ_09755基因簇內(nèi)有VFPBJ_11786和VFPBJ_09756轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)VFPBJ_11784、VFPBJ_11786和VFPBJ_09756基因進(jìn)行超表達(dá)載體構(gòu)建。對(duì)敲除載體(VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因)和超表達(dá)載體(VFPBJ_11784、VFPBJ_11786和VFPBJ_09756基因)進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,由于淡紫擬青霉產(chǎn)孢量大,培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),原生質(zhì)體質(zhì)量不佳及時(shí)間有限問(wèn)題,只得到VFPBJ_09756超表達(dá)轉(zhuǎn)化子。qPCR比較分析野生型菌株和VFPBJ_09756超表達(dá)菌株,結(jié)果顯示在VFPBJ_09756超表達(dá)菌株中,VFPBJ_09755基因簇內(nèi)VFPBJ_09756(編碼真菌Zn(2)-Cys(6)雙核簇)和VFPBJ_09755(聚酮化合物合成酶)基因表達(dá)量上調(diào),同時(shí)VFPBJ_09752(編碼單羧酸通透酶類(lèi)似蛋白)、VFPBJ_09754(編碼金屬-β內(nèi)酰胺酶超家族蛋白)、VFPBJ_09761(編碼黃曲霉毒素調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)域)及VFPBJ_09762(編碼NAD依賴(lài)的表異構(gòu)酶/脫水酶)基因表達(dá)量也上調(diào),而VFPBJ_09755基因簇外大部分基因表達(dá)量并未上調(diào)。HPLC-QTOF-MS聯(lián)用比較分析野生型菌株和VFPBJ_09756超表達(dá)菌株在大麥、MYIZ、MYOG、玉米、MYM、V8、胡蘿卜、番茄、LP和TSSM等10種培養(yǎng)基中分離到的發(fā)酵粗提物。結(jié)果顯示:在V8培養(yǎng)基中,7.8 min、8.25 min、9 min時(shí),VFPBJ_09756超表達(dá)菌株的色譜峰明顯高于野生型菌株,分別提取這四個(gè)時(shí)間段的質(zhì)譜圖,發(fā)現(xiàn)7.8min時(shí)物質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z[M+H]~+)為1234.8,與物質(zhì)Leucinostain k對(duì)應(yīng);在8.25 min時(shí)物質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z[M+H]~+)為1204.8,該物質(zhì)可能為L(zhǎng)eucinostain B;在9 min時(shí)物質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z[M+H]~+)為1104.8,該物質(zhì)可能為L(zhǎng)eucinostain A。在大麥培養(yǎng)基中,比較發(fā)現(xiàn)在8.15 min時(shí),VFPBJ_09756超表達(dá)菌株的色譜峰高于野生型菌株,其所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z[M+H]~+)為1204.8,可能為L(zhǎng)eucinostain B。在MYOG培養(yǎng)基中,比較發(fā)現(xiàn)在7.7 min和8.22 min時(shí),VFPBJ_09756超表達(dá)菌株的色譜峰高于野生型菌株,在7.7 min時(shí)對(duì)應(yīng)質(zhì)荷比為1190.8,可能為L(zhǎng)eucinostain C;在8.22 min時(shí)所對(duì)應(yīng)的荷比為1204.8,可能為物質(zhì)Leucinostain B。然而在其它幾種培養(yǎng)基中,野生型菌株和VFPBJ_09756超表達(dá)菌株分離到的粗提物差異不大。綜上所述,VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因簇可能為聚酮化合物Acremoxanthone C的合成基因簇,VFPBJ_09756基因調(diào)控VFPBJ_09756基因簇中基因的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：山西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S476
【圖文】：

圖 1-1 Acremoxanthone C 和 acremonidinA 的分子結(jié)構(gòu)[36]Figure 1-1 The molecular structure ofAcremoxanthone C and acremonidinA[36]非核糖體肽化合物核糖體肽類(lèi)化合物由 NRPS（Non-ribosomal peptide synthetases）催化合成，體肽的氨基酸包括蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸。每個(gè) NRPS 可劃分為 個(gè)或Module），每個(gè)模塊含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中有 3 個(gè)結(jié)構(gòu)域是必п可少的，包nylation）結(jié)構(gòu)域，其作用是激活特異的氨基酸；T（Thiolation）或者 PCP（Pepprotein）結(jié)構(gòu)域，其作用是轉(zhuǎn)運(yùn)肽鏈；C（Condensation）結(jié)構(gòu)域，其作用是形成肽鍵[40]。73 年，Arai T 等[41]首次發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉能產(chǎn)生 種抗生素 Leucinostatins（白，它是 種非核糖體肽類(lèi)化合物，對(duì)腫瘤細(xì)胞、真菌和革蘭氏陽(yáng)性菌有抑殺作

hiyama A 等發(fā)現(xiàn) LeucinostatinA 和 B 對(duì)引起非洲人類(lèi)錐蟲(chóng)病的錐形蟲(chóng)有很好的抑制用，錐形蟲(chóng) ATP 合成酶的п完整會(huì)減慢細(xì)胞生長(zhǎng)，而 LeucinostatinA 和 B 是線粒體解聯(lián)劑、ATP 合成的抑制劑，同時(shí) LeucinostatinA 是離子載體，可以破壞寄生蟲(chóng)體內(nèi)平，因此對(duì)錐形蟲(chóng)有很好的抑制作用。腫瘤細(xì)胞總是被基質(zhì)細(xì)胞圍繞著，并п單獨(dú)存在，eucinostatinA 是腫瘤-基質(zhì)細(xì)胞互作的調(diào)節(jié)子。2008 年，Kawada 等發(fā)現(xiàn)前列腺 DU-145細(xì)胞у前列腺基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，相比前列腺 DU-145 癌細(xì)胞單獨(dú)存在時(shí) LeucinostatinA前列腺癌細(xì)胞有更好的抑制作用[45]。但當(dāng)時(shí)對(duì) LeucinostatinA 的抑制機(jī)理并п明白，010 年，Kawada 等通過(guò) RT-PCR 揭示了 LeucinostatinA 通過(guò)減少前列腺基質(zhì)細(xì)胞中胰島類(lèi)似生長(zhǎng)因子來(lái)抑制前列腺 DU-145 癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[46]。但 LeucinostatinA 的濃度у對(duì)列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用有何關(guān)系，在體內(nèi)使用時(shí) LeucinostatinA 的濃度應(yīng)保持在范圍，這些問(wèn)題仍值得研究。2017 年 9 月，Abe 等通過(guò)非對(duì)稱(chēng)全合成 LeucinostatinA，結(jié)合核磁共振數(shù)據(jù)、高效液相色譜和生物活性分析表明 LeucinostatinA 的正確結(jié)構(gòu)是前已經(jīng)報(bào)道結(jié)構(gòu)的差向異構(gòu)體[47]。LeucinostatinA 的結(jié)構(gòu)是當(dāng)н 個(gè)頗具爭(zhēng)議的焦點(diǎn)。

堿是指存在于生物體內(nèi)的含氮堿性化合物，大多數(shù)有較為復(fù)雜的含氮環(huán)作用[48]。Teles 等[49]在淡紫擬青霉的生長(zhǎng)期間添加有活性的鼠傷寒沙門(mén)氏射的鼠傷寒沙門(mén)氏菌和經(jīng)高壓滅菌失活的鼠傷寒沙門(mén)氏菌各 1 mL 或 10鼠傷寒沙門(mén)氏菌為對(duì)照，比較發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的大量添加產(chǎn)生的提寒沙門(mén)氏菌的小量添加可以產(chǎn)生有活性的提取物，щ淡紫擬青霉у少量的鼠傷寒沙門(mén)氏菌共培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率最高和質(zhì)譜技術(shù)分析該提取物，得知添加 1 mL 經(jīng)高壓滅菌失活的鼠傷寒沙紫擬青霉產(chǎn)生 種新的化合物 Paecilomide，它是乙酰膽堿酯酶抑制劑，堿。乙酰膽堿是 種大腦神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，它的減少可引起老年癡呆癥，作用于突出間隙，使乙酰膽堿減少，而乙酰膽堿酯酶抑制劑則有利于大積聚，可提高認(rèn)知能力，改善行為和功能障礙，對(duì)老年癡呆癥的治療是

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2752044