【摘要】：淡紫擬青霉(Purpureocillium lilacinum)是一種廣譜性很強的生防菌,其分泌的水解酶類和次級代謝物對植物病蟲害具有很好的防治作用。聚酮化合物是一種常見的次級代謝產(chǎn)物,它是由聚酮化合物合成酶(PKS)催化乙酸、丙二酸或丁酸等脫羧縮合而成,根據(jù)PKS對β-keto基團的還原程度,PKS被分為:非還原型聚酮合酶(NR-PKS)、部分還原型聚酮合酶(PR-PKS)及還原型聚酮合酶(HR-PKS),其中NR-PKS可以催化合成一環(huán)或多環(huán)的芳香型聚酮化合物。前期基因組數(shù)據(jù)預(yù)測淡紫擬青霉有4個NR-PKS基因,分別為VFPBJ_05021、VFPBJ_09342、VFPBJ_09755和VFPBJ_10843基因。Acremoxanthone C是由淡紫擬青霉所產(chǎn)的一種聚酮化合物,是氧雜蒽酮-蒽醌異二聚體,屬鈣調(diào)蛋白抑制劑,參與鈣離子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在新藥發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮重要作用。目前,關(guān)于Acremoxanthone C產(chǎn)生的分子生物學(xué)機制研究仍屬空白,基于此本研究以淡紫擬青霉北京(BJ)菌株為材料,對其RNA-Seq數(shù)據(jù)進行分析,并通過qPCR驗證4個NR-PKS基因簇的轉(zhuǎn)錄組表達量,對VFPBJ_09756基因進行超表達,比較野生型和超表達菌株的產(chǎn)物。具體研究結(jié)果如下:對VFPBJ_05021、VFPBJ_09342、VFPBJ_09755和VFPBJ_10843基因簇的RNA-Seq數(shù)據(jù)進行分析,并提取RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進行qPCR驗證這4個基因簇的轉(zhuǎn)錄組表達。結(jié)果顯示VFPBJ_05021、VFPBJ_09342、VFPBJ_09755和VFPBJ_10843四個基因簇的轉(zhuǎn)錄組表達趨勢與qPCR表達趨勢基本一致。VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因簇都有成簇共表達趨勢,即簇內(nèi)基因表達量比簇外基因表達量相對較高。而VFPBJ_10843基因簇則相反,其簇內(nèi)基因表達量很低,尤其簇內(nèi)合成酶基因幾乎不表達,但簇外基因卻有很高的表達量,故初步確定VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因簇可能為Acremoxanthone C的候選合成基因簇。對VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因進行敲除載體構(gòu)建。VFPBJ_09342基因簇內(nèi)存在VFPBJ_11784轉(zhuǎn)錄因子,VFPBJ_09755基因簇內(nèi)有VFPBJ_11786和VFPBJ_09756轉(zhuǎn)錄因子,對VFPBJ_11784、VFPBJ_11786和VFPBJ_09756基因進行超表達載體構(gòu)建。對敲除載體(VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因)和超表達載體(VFPBJ_11784、VFPBJ_11786和VFPBJ_09756基因)進行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,由于淡紫擬青霉產(chǎn)孢量大,培養(yǎng)時間過長,原生質(zhì)體質(zhì)量不佳及時間有限問題,只得到VFPBJ_09756超表達轉(zhuǎn)化子。qPCR比較分析野生型菌株和VFPBJ_09756超表達菌株,結(jié)果顯示在VFPBJ_09756超表達菌株中,VFPBJ_09755基因簇內(nèi)VFPBJ_09756(編碼真菌Zn(2)-Cys(6)雙核簇)和VFPBJ_09755(聚酮化合物合成酶)基因表達量上調(diào),同時VFPBJ_09752(編碼單羧酸通透酶類似蛋白)、VFPBJ_09754(編碼金屬-β內(nèi)酰胺酶超家族蛋白)、VFPBJ_09761(編碼黃曲霉毒素調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)域)及VFPBJ_09762(編碼NAD依賴的表異構(gòu)酶/脫水酶)基因表達量也上調(diào),而VFPBJ_09755基因簇外大部分基因表達量并未上調(diào)。HPLC-QTOF-MS聯(lián)用比較分析野生型菌株和VFPBJ_09756超表達菌株在大麥、MYIZ、MYOG、玉米、MYM、V8、胡蘿卜、番茄、LP和TSSM等10種培養(yǎng)基中分離到的發(fā)酵粗提物。結(jié)果顯示:在V8培養(yǎng)基中,7.8 min、8.25 min、9 min時,VFPBJ_09756超表達菌株的色譜峰明顯高于野生型菌株,分別提取這四個時間段的質(zhì)譜圖,發(fā)現(xiàn)7.8min時物質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z[M+H]~+)為1234.8,與物質(zhì)Leucinostain k對應(yīng);在8.25 min時物質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z[M+H]~+)為1204.8,該物質(zhì)可能為Leucinostain B;在9 min時物質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z[M+H]~+)為1104.8,該物質(zhì)可能為Leucinostain A。在大麥培養(yǎng)基中,比較發(fā)現(xiàn)在8.15 min時,VFPBJ_09756超表達菌株的色譜峰高于野生型菌株,其所對應(yīng)的物質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z[M+H]~+)為1204.8,可能為Leucinostain B。在MYOG培養(yǎng)基中,比較發(fā)現(xiàn)在7.7 min和8.22 min時,VFPBJ_09756超表達菌株的色譜峰高于野生型菌株,在7.7 min時對應(yīng)質(zhì)荷比為1190.8,可能為Leucinostain C;在8.22 min時所對應(yīng)的荷比為1204.8,可能為物質(zhì)Leucinostain B。然而在其它幾種培養(yǎng)基中,野生型菌株和VFPBJ_09756超表達菌株分離到的粗提物差異不大。綜上所述,VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因簇可能為聚酮化合物Acremoxanthone C的合成基因簇,VFPBJ_09756基因調(diào)控VFPBJ_09756基因簇中基因的表達。
【學(xué)位授予單位】：山西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S476
【圖文】：

圖 1-1 Acremoxanthone C 和 acremonidinA 的分子結(jié)構(gòu)[36]Figure 1-1 The molecular structure ofAcremoxanthone C and acremonidinA[36]非核糖體肽化合物核糖體肽類化合物由 NRPS（Non-ribosomal peptide synthetases）催化合成，體肽的氨基酸包括蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸。每個 NRPS 可劃分為 個或Module），每個模塊含有多個結(jié)構(gòu)域，其中有 3 個結(jié)構(gòu)域是必п可少的，包nylation）結(jié)構(gòu)域，其作用是激活特異的氨基酸；T（Thiolation）或者 PCP（Pepprotein）結(jié)構(gòu)域，其作用是轉(zhuǎn)運肽鏈；C（Condensation）結(jié)構(gòu)域，其作用是形成肽鍵[40]。73 年，Arai T 等[41]首次發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉能產(chǎn)生 種抗生素 Leucinostatins（白，它是 種非核糖體肽類化合物，對腫瘤細胞、真菌和革蘭氏陽性菌有抑殺作

hiyama A 等發(fā)現(xiàn) LeucinostatinA 和 B 對引起非洲人類錐蟲病的錐形蟲有很好的抑制用，錐形蟲 ATP 合成酶的п完整會減慢細胞生長，而 LeucinostatinA 和 B 是線粒體解聯(lián)劑、ATP 合成的抑制劑，同時 LeucinostatinA 是離子載體，可以破壞寄生蟲體內(nèi)平，因此對錐形蟲有很好的抑制作用。腫瘤細胞總是被基質(zhì)細胞圍繞著，并п單獨存在，eucinostatinA 是腫瘤-基質(zhì)細胞互作的調(diào)節(jié)子。2008 年，Kawada 等發(fā)現(xiàn)前列腺 DU-145細胞у前列腺基質(zhì)細胞共培養(yǎng)，相比前列腺 DU-145 癌細胞單獨存在時 LeucinostatinA前列腺癌細胞有更好的抑制作用[45]。但當(dāng)時對 LeucinostatinA 的抑制機理并п明白，010 年，Kawada 等通過 RT-PCR 揭示了 LeucinostatinA 通過減少前列腺基質(zhì)細胞中胰島類似生長因子來抑制前列腺 DU-145 癌細胞的生長[46]。但 LeucinostatinA 的濃度у對列腺癌細胞的生長抑制作用有何關(guān)系，在體內(nèi)使用時 LeucinostatinA 的濃度應(yīng)保持在范圍，這些問題仍值得研究。2017 年 9 月，Abe 等通過非對稱全合成 LeucinostatinA，結(jié)合核磁共振數(shù)據(jù)、高效液相色譜和生物活性分析表明 LeucinostatinA 的正確結(jié)構(gòu)是前已經(jīng)報道結(jié)構(gòu)的差向異構(gòu)體[47]。LeucinostatinA 的結(jié)構(gòu)是當(dāng)н 個頗具爭議的焦點。

堿是指存在于生物體內(nèi)的含氮堿性化合物，大多數(shù)有較為復(fù)雜的含氮環(huán)作用[48]。Teles 等[49]在淡紫擬青霉的生長期間添加有活性的鼠傷寒沙門氏射的鼠傷寒沙門氏菌和經(jīng)高壓滅菌失活的鼠傷寒沙門氏菌各 1 mL 或 10鼠傷寒沙門氏菌為對照，比較發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的大量添加產(chǎn)生的提寒沙門氏菌的小量添加可以產(chǎn)生有活性的提取物，щ淡紫擬青霉у少量的鼠傷寒沙門氏菌共培養(yǎng)時產(chǎn)生的提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制率最高和質(zhì)譜技術(shù)分析該提取物，得知添加 1 mL 經(jīng)高壓滅菌失活的鼠傷寒沙紫擬青霉產(chǎn)生 種新的化合物 Paecilomide，它是乙酰膽堿酯酶抑制劑，堿。乙酰膽堿是 種大腦神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，它的減少可引起老年癡呆癥，作用于突出間隙，使乙酰膽堿減少，而乙酰膽堿酯酶抑制劑則有利于大積聚，可提高認(rèn)知能力，改善行為和功能障礙，對老年癡呆癥的治療是

【參考文獻】

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本文編號：2752044