【摘要】：miRNA對(duì)植物體細(xì)胞胚發(fā)生具有重要的調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究中,以中國(guó)原產(chǎn)細(xì)葉百合為材料,篩選并鑒定了體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中關(guān)鍵差異表達(dá)的lpu-miR171a和lpu-miR171b。本研究在前期工作基礎(chǔ)上,繼續(xù)探討了miR171參與調(diào)控百合離體再生的方式,克隆了MIR171a/b基因初級(jí)轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)及其上游5’端啟動(dòng)子序列,通過(guò)啟動(dòng)子-GUS報(bào)告系統(tǒng)分析了該啟動(dòng)子的功能和miR171基因的表達(dá)模式,從轉(zhuǎn)錄水平探討了miR171調(diào)節(jié)百合體胚發(fā)生的機(jī)制。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)以細(xì)葉百合無(wú)菌苗淲片為外植體,分別通過(guò)直接和間接途徑成功誘導(dǎo)發(fā)生了體細(xì)胞胚。體胚直接誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+4.0μmol·L~-11 PIC+0.01μmol·L~-11 ABA,胚性愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+4.0μmol·L~-11 PIC+25.0μmol·L~-11 SA,誘導(dǎo)率均達(dá)100%。兩種途徑體胚發(fā)生過(guò)程差異較大,直接發(fā)生途徑中鱗片誘導(dǎo)產(chǎn)生球形胚后經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間的心形胚階段和短暫的魚(yú)雷形胚時(shí)期,然后進(jìn)入子葉期;間接發(fā)生途徑中胚性愈傷組織分化形成球形胚后需經(jīng)歷較長(zhǎng)的魚(yú)雷形胚時(shí)期后進(jìn)入子葉期,幾乎觀察不到心形胚時(shí)期。體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的胚性獲得階段,隨體胚誘導(dǎo)率升高,miR171a/b的表達(dá)量下降,而其靶基因SCL6-II/I的表達(dá)量顯著上升。在器官發(fā)生途徑中,不定芽原基形成階段miR171顯著上調(diào)表達(dá)。分析認(rèn)為,在百合離體再生過(guò)程中,miR171通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因SCL6參與了胚性獲得過(guò)程。(2)MIR基因轉(zhuǎn)錄的最初產(chǎn)物初級(jí)轉(zhuǎn)錄本含有短的開(kāi)放閱讀框,能夠通過(guò)編碼短肽,在轉(zhuǎn)錄水平提高其特異miRNA表達(dá)。本研究采用RACE技術(shù),克隆了細(xì)葉百合體胚發(fā)生相關(guān)MIR171a和MIR171b的全長(zhǎng)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本,大小分別為593 bp和404 bp,miR171家族不同成員間初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的保守性較低。莖環(huán)結(jié)構(gòu)pre-miR171a和pre-miR171b到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的距離分別為69 bp和22 bp,到3’polyA的距離分別為326 bp和239 bp。從TSS至pre-miR171的序列內(nèi),分別包含3個(gè)和1個(gè)短的開(kāi)放閱讀框。(3)使用FPNI-PCR的方法進(jìn)行染色體步移,成功克隆MIR171a和MIR171b基因TSS 5’上游側(cè)翼序列1450 bp和952 bp。這兩序列中均含有TATA-Box、CAAT-Box等核心啟動(dòng)元件,以及多個(gè)相同或相似的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),分析認(rèn)為MIR171a和MIR171b的5’上游側(cè)翼序列均有啟動(dòng)下游基因表達(dá)的能力。這兩個(gè)miRNA具有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元,且家族基因不同成員間在轉(zhuǎn)錄水平具有相似的調(diào)節(jié)模式。大量順式作用元件集中分布于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1 kb范圍,主要包括葉肉組織、根、花藥和種子特異性表達(dá)元件,以及響應(yīng)光照、非生物脅迫和細(xì)胞分裂素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸、乙烯等多種植物激素的元件,表明MIR171的調(diào)控方式復(fù)雜,可能受多條信號(hào)通路的共同影響。此外,MIR171基因啟動(dòng)子序列內(nèi)含有大量糖和淀粉代謝響應(yīng)元件,表明MIR171參與了碳水化合物的代謝。(4)根據(jù)MIR171a全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列和順式作用元件分析結(jié)果,克隆了五個(gè)不同長(zhǎng)度的缺失啟動(dòng)子片段。將MIR171a基因的全長(zhǎng)和缺失啟動(dòng)子片段連接GUS報(bào)告基因,構(gòu)建植物表達(dá)載體,使用花序侵染法成功轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。經(jīng)過(guò)逐代抗性篩選鑒定,獲得了T3代轉(zhuǎn)基因種子和植株。T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株組織化學(xué)染色結(jié)果表明,MIR171a基因的上游5’區(qū)域具有啟動(dòng)活性,可驅(qū)動(dòng)GUS基因在擬南芥的子葉、幼根中穩(wěn)定表達(dá)。高光脅迫下,初生真葉中也可檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)。其核心啟動(dòng)區(qū)域在TSS上游-232 bp范圍內(nèi),-650 bp到-823 bp范圍內(nèi)存在特異性增強(qiáng)子。MIR171a啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS在擬南芥中的表達(dá)具有時(shí)空特異性,萌動(dòng)時(shí)GUS表達(dá)量最高,隨著植株生長(zhǎng)逐漸下降,出芽15天后,檢測(cè)不到GUS基因表達(dá)。根據(jù)MIR171a啟動(dòng)子的功能和miR171a在百合體胚發(fā)生中的表達(dá)模式,推測(cè)miR171a可能參與了體胚發(fā)生過(guò)程中子葉原基的發(fā)生和分化。(5)MIR171a啟動(dòng)子可以響應(yīng)光照、非生物脅迫和激素信號(hào)。高光脅迫和光照變化會(huì)誘導(dǎo)GUS含量顯著增加,其光照的響應(yīng)區(qū)域定位在-650 bp到-823 bp之間。miR171啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)量在干旱和高鹽脅迫條件下明顯上調(diào),但響應(yīng)低溫誘導(dǎo)的敏感程度較低。多種激素可以影響MIR171a啟動(dòng)子活性,在ABA、SA和MeJA等抗逆相關(guān)激素的作用下,GUS表達(dá)量升高,而B(niǎo)A則促使其表達(dá)量降低。植物體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中,往往伴隨著大量的逆境響應(yīng),分析認(rèn)為miR171a可能通過(guò)參與逆境響應(yīng)調(diào)控細(xì)葉百合的體胚發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S682.29
【圖文】：

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文多個(gè)突起，這些突起會(huì)發(fā)育形成次生體胚。次生體胚會(huì)不斷分化，會(huì)導(dǎo)增加。在體胚形成和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，接種的鱗片內(nèi)部組織（非切割損、隆起，接種后 50 d，形成少量黃色、干燥、顆粒狀的胚性愈傷組織。在適當(dāng)條件下，也可經(jīng)間接途徑發(fā)育形成體細(xì)胞胚。a cb

圖 2-2 不同濃度 ABA 對(duì) miR171a/b 及其靶基因 SCL6 II/I 的影響Fig.2-2 Expression profiles of miR171 and SCL6 II/I influenced byABA如圖 2-2 所示，miR171 的表達(dá)量受培養(yǎng)基附加 ABA 的影響較大，且對(duì) miR171a 和miR171b 的影響明顯不同。ABA 的濃度為 0 到 10 μmol·L-1范圍內(nèi)，miR171a 的表達(dá)呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)。當(dāng) ABA 濃度為 0.01 μmol·L-1時(shí)，體胚發(fā)生率最高達(dá) 100%，miR171a 的表達(dá)量最低。隨著 ABA 濃度的提高，體胚發(fā)生率逐漸下降，而 miR171a 的表達(dá)量逐漸提高，但表達(dá)量都低于對(duì)照；miR171a 的靶基因 SCL6-II 的表達(dá)與其呈相反趨勢(shì)，當(dāng) ABA 濃度為 0.01 μmol·L-1時(shí)表達(dá)量最高，極顯著高于其它處理，然后隨 ABA濃度的提高逐漸降低。miR171b 的表達(dá)趨勢(shì)與 miR171a 相似，隨著 ABA 濃度的增加，體胚誘導(dǎo)率下降，miR171b 表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，也都低于對(duì)照；miR171b 的靶基因 SCL6-I 的表達(dá)量變化與 SCL6-II 明顯不同，呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng) ABA 濃度為 1μmol·L-1時(shí)表達(dá)量最高，極顯著高于其它處理。此結(jié)果表明，百合兩個(gè) miR171 家族成員的表達(dá)量和體胚發(fā)生能力呈負(fù)相關(guān)，與相對(duì)應(yīng)的靶基因則無(wú)明顯的相關(guān)趨勢(shì)（兩個(gè)miR171 成員間與其靶基因相關(guān)趨勢(shì)完全相反），此結(jié)果與賈娜娜（2016）的報(bào)道相符。這可能與靶基因的表達(dá)除了受 miRNA 調(diào)控之外，還參與了其他的代謝途徑有關(guān)（Xue et

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文常光照下培養(yǎng)，可經(jīng)歷球形胚、魚(yú)雷形胚、子葉形胚最終成苗，主要表現(xiàn)為體胚間生，體胚發(fā)生過(guò)程和 Zhang 等（2016）的報(bào)道一致。間接再生與直接再生相比，沒(méi)顯的心形胚階段，同時(shí)魚(yú)雷形胚階段明顯，具有誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)、體胚誘導(dǎo)率高，畸形率偏高的特點(diǎn)。a b c

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