發(fā)布時間：2020-07-10 14:44

【摘要】：AGO蛋白是RNA沉默途徑的核心蛋白,在RISC中扮演重要角色,AGO蛋白是一類保守蛋白,含四個保守的結(jié)構(gòu)域AgoN、PIWI、PAZ和MID域。其中AgoN參與小RNA的解旋過程;PAZ和MID負責(zé)小RNA的識別和結(jié)合;PIWI具有類似RNaseH的功能,使得AGO蛋白具有催化切割功能,在RNA沉默途徑中起著重要作用。本文從加工番茄cDNA文庫,通過PCR技術(shù)獲得SlAGO4B基因,分析了SlAGO4B的亞細胞定位以及與CMV 2b蛋白的相互作用,構(gòu)建SlAGO4B基因過量表達載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因加工番茄。實驗結(jié)果如下:1.SlAGO4B生物信息學(xué)分析:利用NCBI數(shù)據(jù)庫,獲得加工番茄Sl AGO4B序列信息,設(shè)計引物利用PCR擴增獲得Sl AGO4B基因。利用ORF Finder在線軟件,預(yù)測SlAGO4B開放閱讀框和氨基酸序列;通過Expasy Protparma分析蛋白質(zhì)分子量、等電點及氨基酸組成特征;信號肽和二級結(jié)構(gòu)利用Signal P和SOPMA在線分析;蛋白結(jié)構(gòu)域通過SMART數(shù)據(jù)庫分析;利用MEGA7軟件構(gòu)建AGO蛋白系統(tǒng)進化發(fā)育樹。結(jié)果顯示SlAGO4B基因全長2742bp,編碼913個氨基酸,包含了AGO蛋白保守的AgoN、PIWI、PAZ和MID域,還有DUF1785和AgoL2兩個結(jié)構(gòu)域。SlAGO4B為親水性蛋白,不含有信號肽,不屬于分泌型蛋白;利用MEGA7對番茄AGO蛋白家族和擬南芥AGO蛋白家族做系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)SlAGO4B與AtAGO4在蛋白進化同處于一個進化支,推測二者功能上可能存在一定的相似性。2.SlAGO4B亞細胞定位:將GFP基因與SlAGO4B基因進行融合,構(gòu)建35S:GFP-SlAGO4B融合表達載體。利用農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞,利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在洋蔥表皮細胞的細胞核中出現(xiàn)熒光信號,同時遺傳轉(zhuǎn)化煙草在煙草原生質(zhì)體中熒光信號主要出現(xiàn)在細胞核中,結(jié)果表明SlAGO4B定位在細胞核。3.利用GAL4酵母系統(tǒng)驗證CMV 2b與SlAGO4B互作:將克隆SlAGO4B基因與酵母載體pGAD-T連接,構(gòu)建pGAD-SlAGO4B,CMV 2b與誘餌載體pGBK-T連接,構(gòu)建pGBK-CMV 2b。將此兩個載體共轉(zhuǎn)化AH109中,經(jīng)氨基酸缺陷驗證,與對照相比,發(fā)現(xiàn)pGAD-SlAGO4B和pGBK-CMV 2b在SD/-Leu-Trp-His缺陷培養(yǎng)基中生長,說明SlAGO4B與CMV 2b能夠激活下游報告基因,CMV 2b與SlAGO4B可能存在相互作用。4.SlAGO4B基因植物過量表達載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化:將過量表達載體35S:SlAGO4B利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法遺傳轉(zhuǎn)化加工番茄,獲得再生番茄,提取再生番茄總DNA,經(jīng)PCR鑒定,獲得過量表達番茄5個株系,為研究SlAGO4B基因功能提供遺傳材料。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2
【圖文】：

SlAGO4B二級結(jié)構(gòu)

O4B序列信息分析ORF Finder在線軟件預(yù)測 SlAGO4B開放閱讀框長 2742bSlAGO4B 的 PCR 擴增PCR amplification of SlAGO4Bker 5000；1：Sl AGO4B圖 2.2 T-Sl4B單酶Fig. 2.4 Restriction enzyme digesM：Mark DL 5000，P：T-S

O4B序列信息分析ORF Finder在線軟件預(yù)測 SlAGO4B開放閱讀框長 2742bSlAGO4B 的 PCR 擴增PCR amplification of SlAGO4Bker 5000；1：Sl AGO4B圖 2.2 T-Sl4B單酶Fig. 2.4 Restriction enzyme digesM：Mark DL 5000，P：T-S

【參考文獻】

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本文編號：2749057