【摘要】：昆蟲表皮覆蓋整個蟲體,是昆蟲身體的最外層組織,具有維持蟲體形態(tài)、抵御外源物質(zhì)入侵、防止體內(nèi)水分蒸發(fā)等重要功能。昆蟲體壁由上表皮、原表皮(內(nèi)表皮和外表皮)和真皮細胞構成。昆蟲表皮主要由幾丁質(zhì)、表皮蛋白和脂類組成。不同組織部位表皮結構不同,甚至同一組織部位在不同發(fā)育階段,其化學組成和物理性質(zhì)也存在顯著差異性。表皮蛋白是昆蟲表皮最主要的組分,影響昆蟲表皮形態(tài)及機械特性。飛蝗是全球性的農(nóng)業(yè)害蟲,具有極強的暴發(fā)性,常以群居形式出現(xiàn)且遷飛能力強,蝗災一旦暴發(fā),受災范圍廣,為害嚴重。因此,對于飛蝗表皮蛋白基因功能的研究,有利于掌握其在飛蝗生長發(fā)育過程中的作用,為篩選害蟲防治新的靶標提供理論依據(jù)。本文以飛蝗為研究對象,利用飛蝗蛋白質(zhì)組學分析篩選出3個內(nèi)表皮蛋白LmNCP1、LmNCP2、LmCP6為研究對象,利用RNAi技術探討其在飛蝗表皮發(fā)育過程中的生物學功能,研究結果如下:1、飛蝗表皮蛋白質(zhì)組學分析根據(jù)已有研究報道,利用HE染色方法初步確定飛蝗內(nèi)外表皮形成時間,提取表皮總蛋白進行SDS-PAGE檢測,將該時間節(jié)點飛蝗表皮組織進行Lable free蛋白組學測定,篩選出3個在蛻皮后高表達的表皮蛋白基因,分別是Unigene3699、Unigene2044和Unigene669,推測其與飛蝗內(nèi)表皮的形成有關。2、飛蝗3個內(nèi)表皮蛋白基因的生物信息學分析對飛蝗3個內(nèi)表皮蛋白基因進行生物信息學分析。發(fā)現(xiàn)Unigene3699含有2個外顯子,編碼101個氨基酸。含有1個信號肽,不含幾丁質(zhì)結合域,但具有3個在物種間具有保守性的重復基序。系統(tǒng)進化分析表明Unigene3699與Blaberus craniifer的BcNCP1親緣關系最近,根據(jù)同源性,將其命名為飛蝗LmNCP1。Unigene2044有3個外顯子,編碼205個氨基酸,含有1個信號肽和1個幾丁質(zhì)結合域(ChtBD4);系統(tǒng)進化表明:Unigene2044與蜚蠊目Zootermopsis nevadensis若蟲表皮蛋白2(CP2)具有較高的親緣關系,因此,將其命名為飛蝗LmNCP2。Unigene669含有7個外顯子,編碼359個氨基酸,含有1個信號肽和1個幾丁質(zhì)結合域(ChtBD4)。系統(tǒng)進化表明:Unigene669與昆蟲Cuticle Protein 6聚為一支,故命名為飛蝗LmCP6。3、飛蝗3個內(nèi)表皮蛋白基因的mRNA表達特性分析根據(jù)已獲得的飛蝗3個內(nèi)表皮蛋白基因cDNA序列,設計相應的引物,通過RT-PCR擴增獲得其全長并經(jīng)測序驗證;利用RT-qPCR技術,分析其組織和發(fā)育時期表達,組織部位表達顯示,LmNCP1、LmNCP2和LmCP6分別在體壁和翅芽組織中特異性高表達;發(fā)育時期表達顯示,LmNCP1和LmNCP2在5齡早期高表達,隨后表達量逐漸降低,到下一次蛻皮前表達有所升高;LmCP6在5齡第1-6天(即N5D1-N5D6)表達量逐漸升高,下一次蛻皮前表達降低(即N5D7-N5D8)。20E誘導表達后,LmNCP1和LmCP6表達量顯著上調(diào),LmNCP2顯著下調(diào),分析表明LmNCP1、LmNCP2和LmCP6均參與20E調(diào)控途徑;干擾20E受體EcR和早期轉(zhuǎn)錄因子HR3后,LmNCP1和LmCP6表達量顯著下調(diào),LmNCP2顯著上調(diào),分析表明LmNCP、LmNCP2和LmCP6分別參與EcR和HR3介導的20E調(diào)控通路。4、飛蝗3個內(nèi)表皮蛋白基因LmNCP1、LmNCP2和LmCP6的功能研究由于LmNCP1、LmNCP2和LmCP6的發(fā)育時期表達與內(nèi)表皮形成時間相一致,推測可能參與內(nèi)表皮的形成。本文利用RNAi方法在飛蝗4齡和5齡第2天分次注射dsLmNCP1和dsLmNCP2后,發(fā)現(xiàn)飛蝗仍能夠正常蛻皮,無致死表型,但對其表皮進行HE染色,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,其內(nèi)表皮形成量減少,導致表皮顯著變薄。而沉默dsLmCP6后,飛蝗可發(fā)育至成蟲,但處理組成蟲翅變得卷曲、皺縮,說明其可能參與成蟲翅的結構形成。飛蝗是典型的不完全變態(tài)昆蟲,也是世界性的重要農(nóng)業(yè)害蟲。對于飛蝗表皮蛋白基因的研究,對于飛蝗有效治理具有重要意義。本文從飛蝗蛋白組學分析、飛蝗內(nèi)表皮蛋白基因生物信息學分析、飛蝗內(nèi)表皮蛋白基因mRNA表達特性分析以及飛蝗內(nèi)表皮蛋白基因功能分析4個方面開展了飛蝗內(nèi)表皮蛋白基因功能研究,為飛蝗分子靶標的篩選和研發(fā)提供了理論和實踐依據(jù)。
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S433.2
【圖文】：

圖 1-1 昆蟲體壁結構示意圖[8]Fig. 1-1 The structure of insect integument表皮； Procuticle：原表皮；Exocuticle：外表皮；Endocuticle：內(nèi)表皮真皮細胞層；Basement membrane：基底膜表皮蛋白分類皮蛋白（ICPs）是結構蛋白，根據(jù)其幾丁質(zhì)結合域的不同，類幾丁質(zhì)結合域為 R&R 基序（Rebers and Riddiford Consens-2 和 RR-3 三個亞類[9,10]，統(tǒng)稱為 CPR 家族，該類表皮蛋白廣另一類幾丁質(zhì)結合域為 the type 2 chitin-binding domain (ChtBD有 3 個二硫鍵（6 個半胱氨酸殘基組成）保守序列，此類結構昆蟲表皮和圍食膜中[11,12]。守基序的不同，表皮蛋白可以分為以下幾個家族：（1）CPR主要存在于昆蟲的柔軟表皮中、 RR-2 亞類主要存在于堅硬

本文研究方法與技術路線圖

11圖 2-1 非標記蛋白質(zhì)組學技術（lable-free）Fig.2-1 The non-labeled protemic technology（http://www.keecloud.com/label-free）[46]觀察四齡剛剛蛻成五齡時飛蝗只有上表皮和外表皮（36 h 可觀察到明顯的內(nèi)表皮，72 h 后內(nèi)表皮基本

【參考文獻】

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本文編號：2749180