【摘要】：桃[Prunus persica(L.)Batsch]新梢生長(zhǎng)量大,樹冠濃密,修剪量大,易造成樹體營(yíng)養(yǎng)浪費(fèi),增加生產(chǎn)成本,培育有限矮化、管理省工、適宜密植的生長(zhǎng)型是桃遺傳改良目標(biāo)之一。本研究在明確表型響應(yīng)溫度和已有研究基礎(chǔ)上(定位區(qū)間270 Kb),以溫敏半矮生型桃為載體,開展內(nèi)源BR響應(yīng)溫度變化、基因精細(xì)定位、雜種后代分子鑒定及候選區(qū)基因的SNP、InDel和結(jié)構(gòu)變異分析等研究。主要研究結(jié)果如下:系統(tǒng)研究了溫度對(duì)溫敏半矮生型和普通生長(zhǎng)型桃節(jié)間長(zhǎng)度與內(nèi)源油菜素甾醇的影響。采用雙溫度法(22℃和30℃)進(jìn)行表型鑒定,‘09-8-25’ב中桃白玉’雜交獲得F_1代275株實(shí)生苗,22℃時(shí)表現(xiàn)為節(jié)間長(zhǎng)度極短,呈極度矮化狀態(tài),而30℃時(shí)節(jié)間伸長(zhǎng),與普通生長(zhǎng)型節(jié)間無明顯差異的植株為溫敏半矮生型(Temperature Sensitive Semi-dwarf Peach,PpTssd);22℃與30℃節(jié)間長(zhǎng)度均較長(zhǎng)且無明顯差異的植株為普通生長(zhǎng)型(Standard Type,ST)。研究不同溫度(22℃、26℃和30℃)對(duì)PpTssd型植株莖尖油菜素甾醇水平的影響發(fā)現(xiàn),在各溫度處理的植株莖尖中均未檢測(cè)到油菜素內(nèi)酯成分;油菜素甾酮含量在3種溫度處理?xiàng)l件下差異不明顯,30℃時(shí)油菜素甾酮的鮮重含量?jī)H為22℃的1.329倍;香蒲甾醇含量在各溫度處理間具有顯著差異,30℃處理?xiàng)l件下的香蒲甾醇含量是22℃的2.917倍,香蒲甾醇可能與突變性狀有關(guān)。建立了一種高通量桃DNA提取方法。以‘09-1-112’(Pp Tssd)ב中油桃8號(hào)’(ST)雜交F_1代500株實(shí)生苗為載體,利用1.2 mL八聯(lián)排管結(jié)合改良CTAB法,提取桃幼嫩葉片中的基因組DNA。經(jīng)檢測(cè),提取的DNA濃度范圍約25 ng·μL~(-1)~200 ng·μL~(-1),OD260_(nm)/OD280_(nm)約為1.81~1.98,純度和完整度較高。利用高分辨率熔解曲線進(jìn)行驗(yàn)證,PpTssd型和普通生長(zhǎng)型呈現(xiàn)明顯不同的峰型,分辨率高;聚丙烯酰胺凝膠電泳的驗(yàn)證結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增穩(wěn)定,條帶清晰,多態(tài)性較高;因此,提取的DNA可用于基于SNP/InDel標(biāo)記的基因分型。利用本研究方法,每人每天可以完成1000個(gè)樣品的DNA提取,可用于后續(xù)目的基因精細(xì)定位�；陔p親(‘09-8-25’‘中桃白玉’)重測(cè)序?qū)pTssd基因進(jìn)行了精細(xì)定位。利用上述方法提取‘09-8-25’ב中桃白玉’雜交F_1代275株實(shí)生苗基因組DNA,基于雙親深度測(cè)序,根據(jù)親本的基因型與表型一致,開發(fā)SNP/InDel標(biāo)記共38對(duì),其中16對(duì)與目標(biāo)性狀連鎖,將目的基因定位至Pp03-SNP_3480000與Pp03-SNP_3553771兩標(biāo)記之間,物理距離約74 Kb,共包含8個(gè)轉(zhuǎn)錄本,7個(gè)候選基因。基于熒光標(biāo)記SSR毛細(xì)管電泳,對(duì)雜交后代6株重組單株進(jìn)行分子鑒定。經(jīng)檢測(cè),16對(duì)熒光SSR引物中,10對(duì)在雙親‘09-8-25’、‘中桃白玉’具有多態(tài)性差異,多態(tài)率為62.5%。毛細(xì)管電泳分析結(jié)果顯示,6個(gè)交換單株均為‘09-8-25’ב中桃白玉’雜交F_1代,分子鑒定率為100%�；赟anger測(cè)序與二代測(cè)序數(shù)據(jù),分析候選區(qū)間基因的遺傳變異。比較AA、aa基因型植株精細(xì)定位區(qū)間genomic DNA序列,分析SNP、InDel和結(jié)構(gòu)變異,發(fā)現(xiàn)在Purpe.3G049700基因5’UTR存在約377 bp缺失,該位點(diǎn)僅存在于PpTssd中,為可能的候選基因。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S662.1
【圖文】：

學(xué)院碩士學(xué)位論文常廣泛，既可以直立生長(zhǎng)又可延伸生長(zhǎng)。短枝型桃的主干、枝條長(zhǎng)度、分枝角度比較短，節(jié)間較短，葉片較小，該樹型是優(yōu)化樹體結(jié)構(gòu)進(jìn)行遺傳改良的重要資源）。垂枝型桃，樹體高度幾乎與普通生長(zhǎng)型無差異，主要特點(diǎn)是枝條下垂，披散似，樹冠呈傘狀（Leuty et al.，1980）。國內(nèi)外研究者對(duì)桃垂枝性狀進(jìn)行研究，沈向等（進(jìn)行研究，通過外施赤霉素類似物對(duì)垂枝角度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)源激素 GA下垂的重要因素，該性狀受顯性單基因控制。意大利的 Bassi 科研團(tuán)隊(duì)對(duì)垂枝型在利用垂枝型桃構(gòu)建一種類似梨 Lepage 體系（Bassi et al.，1994），為后人研究礎(chǔ)。Hollender 等（2018）將控制垂枝性狀的基因定位至第 3 號(hào)染色體，并對(duì)其為樹型改良奠定基礎(chǔ)。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文SSR 標(biāo)記的開發(fā)成本較高，且耗時(shí)長(zhǎng)，但桃基因組中的 SSR 標(biāo)記具有交叉性，開發(fā)后，可應(yīng)用于多個(gè)李屬植物中，可以彌補(bǔ)開發(fā)成本較高的缺點(diǎn)（Cipriani et al.，1999；Downey et al.，2000；Hormaza et al.，2002；Sosinski et al.，2000）。Downey 和 Iezzoni 利用桃 SSR 標(biāo)記分析黑櫻桃（Prunusserotina）的遺傳多樣性（Downey et al.，2000）。Sosinski 開發(fā)的桃 SSR 標(biāo)記，其中一部分可以應(yīng)用于杏樹（Prunus armeniaca）和歐洲酸櫻桃（Prunus cerasus）遺傳研究中（Sosinski et al.，2000）。從豐富 SSR 文庫中篩選用于基因定位的多態(tài)性標(biāo)記，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高；全基因組測(cè)序的完成為第三代分子標(biāo)記的誕生提供了契機(jī)。SNP 標(biāo)記（單核苷酸多態(tài)性），是單個(gè)堿基突變?cè)斐傻亩鄳B(tài)性�；诟咄炕蚍中推脚_(tái)的建立，SNPs 被廣泛應(yīng)用于飽和遺傳圖譜的建立（Gundersonet al.，2009）。依托 Illumina 平臺(tái)，高通量 SNPs 分析工具已經(jīng)在李屬植物中開發(fā)，并應(yīng)用于品種基因分型和大規(guī)�；蚍治觯≒eace et al.，2012；Verde et al.，2012；Micheletti et al.，2012）�；� SNP 進(jìn)行基因定位的成本仍比較昂貴，不適用于每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室。由于 SSRs 的檢測(cè)成本較低，且在基因組中豐富存在，其在種質(zhì)遺傳研究與指紋圖譜構(gòu)建方面具有更廣泛的應(yīng)用。

圖 2.1 溫度處理植株表型鑒定Fig.2.1 Phenotype identification based on temperature treatment圖 2.2 不同溫度 BR 類內(nèi)源激素含量Fig 2.2 The BR content on different temperature treatment

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2747321