【摘要】：首次在瘤背石磺(Onchidium struma)中克隆得到一種新的表皮生長因子(EGF)的cDNA序列全長。EGF基因cDNA的全長為1158bp,命名為Os-egf1,其中開放閱讀框長度為846 bp,編碼一條包含281個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。根據(jù)氨基酸序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其含有2個(gè)保守的EGF結(jié)構(gòu)域和1個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域中均包含至少6個(gè)半胱氨酸殘基,且形成CX7 CX4-5 CX10-13CXCX8 C結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)域由C1~C3、C2~C4和C5~C6之間形成的3個(gè)二硫鍵維持,符合表皮生長因子家族及其相關(guān)蛋白的特征結(jié)構(gòu)域,但其余氨基酸序列與現(xiàn)有相關(guān)基因差異較大,推測(cè)可能是一種新的EGF-like基因。利用MEGA6.0軟件構(gòu)建Os-egf1與EGF家族相關(guān)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹,表明EGF家族蛋白具有一定的物種特異性。
【圖文】：

?膜內(nèi)1~16aa,膜上17~39aa,膜外40~281aa)。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件NetPhos2.0Serber顯示Os-egf1基因含有6個(gè)Ser、3個(gè)Thr、3個(gè)Tyr,可能為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明Os-egf1基因定位在細(xì)胞外,是分泌性蛋白的可能性較大。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)軟件SMART顯示Os-egf1基因含有2個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域(46~77aa、139~170aa)和一個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域(92~137aa),每個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域均包含6個(gè)半胱氨酸殘基,結(jié)構(gòu)域內(nèi)部各自形成3個(gè)二硫鍵,EGF-like結(jié)構(gòu)域包含8個(gè)半胱氨酸殘基。使用SWISSmodel軟件對(duì)Os-egf1氨基酸序列進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果如圖1。圖1Os-egf1氨基酸序列的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.1Three-dimensionalstructurepredictionmapofOs-egf1aminoacidsequence將Os-egf1的氨基酸序列在NCBI中Blast同源性比對(duì)得知,與其匹配度最高的是腹足綱生物Biomphalariaglabrata中的multipleepidermalgrowthfactor-likedomainsprotein10蛋白序列(XP_013086610.1),匹配度達(dá)到51%。相似度較低一點(diǎn)的是Crassostreagigas,同樣是multipleepidermalgrowthfactor-likedomainsprotein10的蛋白序列(XP_011433900.1),同源性為43%。將兩者的氨基酸序列同Os-egf1進(jìn)行多重序列比對(duì)后,結(jié)果如圖2所示。瘤背石磺Os-egf1基因cDNA序列及其編碼的氨基酸序列如圖3所示。使用BioEdit軟件將瘤背石磺Os-egf1基因的3個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域同EGF家族及其相關(guān)蛋白的EGF-like結(jié)構(gòu)域做比較,結(jié)果表明Os-egf1與EGF家族及相關(guān)蛋白的6個(gè)半胱氨酸殘基是高度保守的,且均符合CX7CX4-5CX10-13CXCX8C結(jié)構(gòu),如圖4。

MarineSciences/Vol.41,No.3/201711圖2Os-egf1的氨基酸序列與同源性較高的EGF-like的多重序列比對(duì)結(jié)果Fig.2TheresultofmultiplesequencealignmentofOs-egf1aminoacidsequencewithEGF-likegene使用Mega6.0軟件,對(duì)瘤背石磺Os-egf1及EGF家族其他成員的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹圖5。結(jié)果表明,大體上EGF家族每個(gè)成員的不同物種基因相應(yīng)的聚為群組。Gryllusbimaculatus的TGF-α蛋白單獨(dú)聚為一支,小家鼠(Musmusculus)和人類(Homosapiens)的相關(guān)蛋白聚為一支,Os-egf1單獨(dú)聚為一支,剩余4種的EGF相關(guān)蛋白形成兩分支又聚為一支。

12海洋科學(xué)/2017年/第41卷/第3期圖3瘤背石磺Os-egf1基因cDNA序列及其編碼的氨基酸序列Fig.3NucleotideanddeducedaminoacidsequencesofOs-egf1fromOnchidiumstruma圖中藍(lán)色字體為起始密碼子和終止密碼子,黑色加粗字體為加尾信號(hào);陰影部分是保守的EGF-like結(jié)構(gòu)域,紅色字體為6個(gè)典型的半胱氨酸殘基Blueindicatestheinitiationcodonandstopcodon;boldblackindicatespolyadenylationsignals;shadowindicatestheconservedEGF-likedomain;redindicatessixtypicalcysteineresidues3討論表皮生長因子(EGF)家族的研究報(bào)道在脊椎動(dòng)物中比較豐富。本文利用瘤背石磺轉(zhuǎn)錄組,首次在該物種中克隆得到EGF-like基因Os-egf1,通過功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)其包含1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(17~39aa)、2個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域(46~77aa、139~170aa)和一個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域(92~137aa),將其與家族中其他成員及其相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)域比較,發(fā)現(xiàn)Os-egf1和他們有著相同的EGF-like結(jié)構(gòu)特征,包含典型的6個(gè)半胱氨酸殘基,且符合CX7CX4-5CX10-13CXCX8C結(jié)構(gòu),其中完全保守的6個(gè)半胱氨酸殘基C1~C3、C2~C4和C5~C6

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