【摘要】：該文使用新型懸浮細胞連續(xù)培養(yǎng)法從人乳腺癌細胞MDA-MB-435中分離出類腫瘤干細胞株(MDA-435-spheroid enrichment,MDA-435-SE),并通過流式細胞術檢測細胞表面標志物以及裸鼠皮下成瘤實驗,對MDA-435-SE細胞的類腫瘤干細胞特性進行了驗證。然后對MDA-435-SE細胞進行慢病毒感染,建立了穩(wěn)定敲低Sec23a基因表達的細胞株MDA-435-SE-sh Sec23a和陰性對照細胞株MDA-435-SE-LV3NC,通過Cell Counting Kit-8增殖實驗、96孔板單克隆成球實驗和裸鼠皮下成瘤實驗探索Sec23a基因對乳腺癌類腫瘤干細胞MDA-435-SE的干性調控作用。在乳腺癌類腫瘤干細胞MDA-435-SE中敲低Sec23a基因后,細胞的增殖曲線和倍增時間并沒有明顯改變,但細胞的體外成球直徑和單細胞克隆效率均顯著增強。動物實驗表明,Sec23a基因的敲低可以顯著提高乳腺癌類腫瘤干細胞MDA-435-SE的體內成瘤能力。該研究使用新型懸浮細胞連續(xù)培養(yǎng)的方法獲得來源于人乳腺癌的類腫瘤干細胞株,并使用體內和體外干性相關實驗驗證了敲低Sec23a基因后,可以顯著提高乳腺癌類腫瘤干細胞MDA-435-SE的干性,對腫瘤干細胞的研究具有重要的參考意義。
【圖文】：

A-435-SE細胞相對于MDA-MB-435細胞是否具有類腫瘤干細胞的特性,我們設置了1000個細胞劑量的裸鼠皮下成瘤實驗。如圖3所示,實驗結果表明,MDA-MB-435細胞不具有裸鼠皮下成瘤能力,而通過新型懸浮細胞連續(xù)培養(yǎng)法獲得的MDA-435-SE細胞具有很強的裸鼠皮下成瘤能力,說明MDA-435-SE細胞具有類腫瘤干細A:呈梭形分化貼壁生長的MDA-MB-435細胞;B:呈懸浮成球聚集生長的MDA-435-SE細胞。A:imageoffusiformadherentMDA-MB-435cells;B:imageofsuspendingsphericalMDA-435-SEcells.圖1MDA-MB-435和MDA-435-SE細胞的不同生長形態(tài)Fig.1DifferentgrowthmorphologiesofMDA-MB-435andMDA-435-SEcells(A)(B)120m120m(A)(B)CD24PE-AQ1-LL(0.16%)Q1-LR(0.05%)Q1-UL(7.94%)Q1-UR(91.85%)Q1-LL(0.55%)Q1-LR(0.11%)Q1-UL(17.18%)Q1-UR(82.16%)CD24PE-ACD44APC-ACD44APC-A103104105103104103104103104105A:MDA-MB-435細胞中CD44和CD24的檢測;B:MDA-435-SE細胞中CD44和CD24的檢測。A:flowcytometryofCD44andCD24inMDA-MB-435cells;B:flowcytometryofCD44andCD24inMDA-435-SEcells.圖2流式細胞術檢測MDA-MB-435和MDA-435-SE細胞中CD44和CD24的表達Fig.2DeterminationofCD44andCD24inMDA-MB-435andMDA-435-SEcellsbyflowcytometry

周仕霞等:Sec23a基因對人乳腺癌類腫瘤干細胞的干性抑制作用研究651集的MDA-435-SE細胞,置于含5%胎牛血清、1%雙抗和1%兩性霉素B的DMEM培養(yǎng)基中進行連續(xù)傳代、培養(yǎng)(圖1)。2.2MDA-MB-435和MDA-435-SE細胞中CD44和CD24的表達CD44高表達并且CD24低表達是乳腺癌腫瘤干細胞的標志。我們使用流式細胞術檢測MDA-MB-435和MDA-435-SE細胞中CD44和CD24的表達。如圖2所示,在MDA-MB-435細胞中,CD44高表達與CD24低表達的細胞亞群比例為7.94%,而在MDA-435-SE細胞中,其比例為17.18%。此結果說明,采用的新型懸浮細胞連續(xù)培養(yǎng)法可以顯著提高乳腺癌細胞中腫瘤干細胞亞群的比例,同時說明MDA-435-SE細胞相對于MDA-MB-435細胞具有類腫瘤干細胞的特性。2.3MDA-MB-435和MDA-435-SE細胞的裸鼠皮下成瘤能力比較為了進一步驗證MDA-435-SE細胞相對于MDA-MB-435細胞是否具有類腫瘤干細胞的特性,我們設置了1000個細胞劑量的裸鼠皮下成瘤實驗。如圖3所示,實驗結果表明,MDA-MB-435細胞不具有裸鼠皮下成瘤能力,而通過新型懸浮細胞連續(xù)培養(yǎng)法獲得的MDA-435-SE細胞具有很強的裸鼠皮下成瘤能力,說明MDA-435-SE細胞具有類腫瘤干細A:呈梭形分化貼壁生長的MDA-MB-435細胞;B:呈懸浮成球聚集生長的MDA-435-SE細胞。A:imageoffusiformadherentMDA-MB-435cells;B:imageofsuspendingsphericalMDA-435-SEcells.圖1MDA-MB-435和MDA-435-SE細胞的不同生長形態(tài)Fig.1DifferentgrowthmorphologiesofMDA-MB-435andMDA-435-SEcells(A)(B)120m120m(A)(B)CD24PE-AQ1-LL(0.

說明慢病毒感染有效敲低了SEC23A蛋白質水平(圖6,P<0.001)。2.6敲低Sec23a基因對MDA-435-SE細胞體外增殖特性的影響使用CCK-8檢測法檢測MDA-435-SE-LV3NC和MDA-435-SE-shSec23a細胞的增殖特性,繪制生長曲線并計算細胞倍增時間。實驗結果表明,MDA-435-SE-LV3NC和MDA-435-SE-shSec23a細胞的生長曲線趨勢十分一致,兩者倍增時間分別為26.95h和26.04h,并無顯著差異(圖7,P>0.05)。這說明,敲低Sec23a的表達并未影響MDA-435-SE細胞的增殖特性。圖3MDA-MB-435和MDA-435-SE細胞的裸鼠皮下成瘤檢測Fig.3TumorigenicitiesinthenudemiceofMDA-MB-435andMDA-435-SEcellsMDA-435-SE1000cellsMDA-MB-4351000cells120.0***100.080.060.040.020.00RelativeexpressionofmRNA(percentageofMDA-MB-435)(%)MDA-MB-435MDA-435-SE***P<0.001.圖4RT-PCR檢測MDA-MB-435和MDA-435-SE細胞中Sec23amRNA水平Fig.4TherelativelevelofSec23amRNAinMDA-MB-435andMDA-435-SEcellsmeasuredbyRT-PCR

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