【摘要】：該文使用新型懸浮細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)法從人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435中分離出類腫瘤干細(xì)胞株(MDA-435-spheroid enrichment,MDA-435-SE),并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物以及裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),對MDA-435-SE細(xì)胞的類腫瘤干細(xì)胞特性進(jìn)行了驗(yàn)證。然后對MDA-435-SE細(xì)胞進(jìn)行慢病毒感染,建立了穩(wěn)定敲低Sec23a基因表達(dá)的細(xì)胞株MDA-435-SE-sh Sec23a和陰性對照細(xì)胞株MDA-435-SE-LV3NC,通過Cell Counting Kit-8增殖實(shí)驗(yàn)、96孔板單克隆成球?qū)嶒?yàn)和裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)探索Sec23a基因?qū)θ橄侔╊惸[瘤干細(xì)胞MDA-435-SE的干性調(diào)控作用。在乳腺癌類腫瘤干細(xì)胞MDA-435-SE中敲低Sec23a基因后,細(xì)胞的增殖曲線和倍增時(shí)間并沒有明顯改變,但細(xì)胞的體外成球直徑和單細(xì)胞克隆效率均顯著增強(qiáng)。動物實(shí)驗(yàn)表明,Sec23a基因的敲低可以顯著提高乳腺癌類腫瘤干細(xì)胞MDA-435-SE的體內(nèi)成瘤能力。該研究使用新型懸浮細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)的方法獲得來源于人乳腺癌的類腫瘤干細(xì)胞株,并使用體內(nèi)和體外干性相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了敲低Sec23a基因后,可以顯著提高乳腺癌類腫瘤干細(xì)胞MDA-435-SE的干性,對腫瘤干細(xì)胞的研究具有重要的參考意義。
【圖文】：

A-435-SE細(xì)胞相對于MDA-MB-435細(xì)胞是否具有類腫瘤干細(xì)胞的特性,我們設(shè)置了1000個(gè)細(xì)胞劑量的裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)。如圖3所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MDA-MB-435細(xì)胞不具有裸鼠皮下成瘤能力,而通過新型懸浮細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)法獲得的MDA-435-SE細(xì)胞具有很強(qiáng)的裸鼠皮下成瘤能力,說明MDA-435-SE細(xì)胞具有類腫瘤干細(xì)A:呈梭形分化貼壁生長的MDA-MB-435細(xì)胞;B:呈懸浮成球聚集生長的MDA-435-SE細(xì)胞。A:imageoffusiformadherentMDA-MB-435cells;B:imageofsuspendingsphericalMDA-435-SEcells.圖1MDA-MB-435和MDA-435-SE細(xì)胞的不同生長形態(tài)Fig.1DifferentgrowthmorphologiesofMDA-MB-435andMDA-435-SEcells(A)(B)120m120m(A)(B)CD24PE-AQ1-LL(0.16%)Q1-LR(0.05%)Q1-UL(7.94%)Q1-UR(91.85%)Q1-LL(0.55%)Q1-LR(0.11%)Q1-UL(17.18%)Q1-UR(82.16%)CD24PE-ACD44APC-ACD44APC-A103104105103104103104103104105A:MDA-MB-435細(xì)胞中CD44和CD24的檢測;B:MDA-435-SE細(xì)胞中CD44和CD24的檢測。A:flowcytometryofCD44andCD24inMDA-MB-435cells;B:flowcytometryofCD44andCD24inMDA-435-SEcells.圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測MDA-MB-435和MDA-435-SE細(xì)胞中CD44和CD24的表達(dá)Fig.2DeterminationofCD44andCD24inMDA-MB-435andMDA-435-SEcellsbyflowcytometry

周仕霞等:Sec23a基因?qū)θ巳橄侔╊惸[瘤干細(xì)胞的干性抑制作用研究651集的MDA-435-SE細(xì)胞,置于含5%胎牛血清、1%雙抗和1%兩性霉素B的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)傳代、培養(yǎng)(圖1)。2.2MDA-MB-435和MDA-435-SE細(xì)胞中CD44和CD24的表達(dá)CD44高表達(dá)并且CD24低表達(dá)是乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志。我們使用流式細(xì)胞術(shù)檢測MDA-MB-435和MDA-435-SE細(xì)胞中CD44和CD24的表達(dá)。如圖2所示,在MDA-MB-435細(xì)胞中,CD44高表達(dá)與CD24低表達(dá)的細(xì)胞亞群比例為7.94%,而在MDA-435-SE細(xì)胞中,其比例為17.18%。此結(jié)果說明,采用的新型懸浮細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)法可以顯著提高乳腺癌細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞亞群的比例,同時(shí)說明MDA-435-SE細(xì)胞相對于MDA-MB-435細(xì)胞具有類腫瘤干細(xì)胞的特性。2.3MDA-MB-435和MDA-435-SE細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力比較為了進(jìn)一步驗(yàn)證MDA-435-SE細(xì)胞相對于MDA-MB-435細(xì)胞是否具有類腫瘤干細(xì)胞的特性,我們設(shè)置了1000個(gè)細(xì)胞劑量的裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)。如圖3所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MDA-MB-435細(xì)胞不具有裸鼠皮下成瘤能力,而通過新型懸浮細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)法獲得的MDA-435-SE細(xì)胞具有很強(qiáng)的裸鼠皮下成瘤能力,說明MDA-435-SE細(xì)胞具有類腫瘤干細(xì)A:呈梭形分化貼壁生長的MDA-MB-435細(xì)胞;B:呈懸浮成球聚集生長的MDA-435-SE細(xì)胞。A:imageoffusiformadherentMDA-MB-435cells;B:imageofsuspendingsphericalMDA-435-SEcells.圖1MDA-MB-435和MDA-435-SE細(xì)胞的不同生長形態(tài)Fig.1DifferentgrowthmorphologiesofMDA-MB-435andMDA-435-SEcells(A)(B)120m120m(A)(B)CD24PE-AQ1-LL(0.

說明慢病毒感染有效敲低了SEC23A蛋白質(zhì)水平(圖6,P<0.001)。2.6敲低Sec23a基因?qū)DA-435-SE細(xì)胞體外增殖特性的影響使用CCK-8檢測法檢測MDA-435-SE-LV3NC和MDA-435-SE-shSec23a細(xì)胞的增殖特性,繪制生長曲線并計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MDA-435-SE-LV3NC和MDA-435-SE-shSec23a細(xì)胞的生長曲線趨勢十分一致,兩者倍增時(shí)間分別為26.95h和26.04h,并無顯著差異(圖7,P>0.05)。這說明,敲低Sec23a的表達(dá)并未影響MDA-435-SE細(xì)胞的增殖特性。圖3MDA-MB-435和MDA-435-SE細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤檢測Fig.3TumorigenicitiesinthenudemiceofMDA-MB-435andMDA-435-SEcellsMDA-435-SE1000cellsMDA-MB-4351000cells120.0***100.080.060.040.020.00RelativeexpressionofmRNA(percentageofMDA-MB-435)(%)MDA-MB-435MDA-435-SE***P<0.001.圖4RT-PCR檢測MDA-MB-435和MDA-435-SE細(xì)胞中Sec23amRNA水平Fig.4TherelativelevelofSec23amRNAinMDA-MB-435andMDA-435-SEcellsmeasuredbyRT-PCR

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