【摘要】：蘋果小吉丁蟲(Agrilus mali Masumura)是一種重要的蛀干害蟲,主要危害薔薇科、蘋果屬的多種經(jīng)濟(jì)林樹種。近年來(lái),在新疆蘋果樹上發(fā)生嚴(yán)重,特別對(duì)新疆天山野果林主要建群樹種—新疆野蘋果幾乎造成毀滅性破壞。該害蟲幼蟲期長(zhǎng),鉆蛀植物韌皮部取食為害,成蟲生活期短,取食寄主植物葉片補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)后,選擇合適的產(chǎn)卵場(chǎng)所繁殖后代,所以成蟲期是防治的關(guān)鍵時(shí)期。寄主植物揮發(fā)物在成蟲選擇寄主植物過(guò)程中發(fā)揮重要作用,蘋果小吉丁蟲能夠通過(guò)靈敏的嗅覺(jué)系統(tǒng)感受寄主釋放的主要揮發(fā)物組分識(shí)別寄主植物。目前對(duì)該害蟲化學(xué)生態(tài)方面的研究還是空白,解析害蟲與寄主植物的互作有利于明確該蟲的寄主選擇機(jī)制,為發(fā)展以植物源誘捕劑為主的綠色防治手段提供理論和技術(shù)依據(jù)。本研究鑒定了寄主和非寄主植物葉片釋放的揮發(fā)性物質(zhì),利用二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)挖掘蘋果小吉丁蟲觸角中相關(guān)的嗅覺(jué)基因,測(cè)定氣味結(jié)合蛋白和化學(xué)感受蛋白基因結(jié)合寄主植物揮發(fā)物的能力,通過(guò)電生理和行為生理試驗(yàn)篩選出對(duì)害蟲有較強(qiáng)吸引趨性的揮發(fā)性化合物,主要結(jié)果如下:蘋果小吉丁蟲對(duì)4種植物垂絲海棠、秦冠蘋果、杜梨和秦王的選擇偏好性和取食量存在明顯差異。雌蟲偏好在海棠和蘋果上取食活動(dòng),對(duì)梨和桃的選擇率較低。無(wú)競(jìng)爭(zhēng)和兩項(xiàng)競(jìng)爭(zhēng)條件下,雌蟲對(duì)海棠葉片的取食量最大,其次為蘋果,但不取食梨和桃樹葉片,表明海棠和蘋果是該蟲的寄主植物,梨和桃是非寄主植物。利用動(dòng)態(tài)頂空吸附法收集寄主和非寄主植物葉片釋放的揮發(fā)物,GC-MS共鑒定到71種化合物,包括5種烷烴,2種醚,11種醇,2種酮,8種醛,23種酯,4種烯烴,15種萜類和1種腈類物質(zhì),每種化合物的含量在4種植物間存在差異。通過(guò)對(duì)所有揮發(fā)性化合物含量進(jìn)行因子分析,發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)聚類形成3個(gè)代表性復(fù)合因子,累計(jì)解釋總方差概率的93.62%。復(fù)合因子1、2、3中貢獻(xiàn)率較大(絕對(duì)值大于0.7)的物質(zhì)分別有25、19和15種,分別解釋了總方差概率的41.98%、31.82%和19.83%。對(duì)3個(gè)復(fù)合因子總得分進(jìn)行方差分析,結(jié)果表明對(duì)復(fù)合因子1、2、3貢獻(xiàn)率大的分別是蘋果、桃和海棠葉片釋放的揮發(fā)物組分。利用復(fù)合因子1和2進(jìn)行主成份分析,表明蘋果和桃樹葉片釋放的揮發(fā)物組分含量差異較大,海棠和梨樹葉片釋放的揮發(fā)物組分含量差異較小。采用Illumina HiSeq二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)蘋果小吉丁蟲雌、雄蟲觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序,共鑒定到63條嗅覺(jué)相關(guān)基因,包括11條OBP、8條CSP、17條OR、9條GR、17條IR和1條SNMP基因。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明蘋果小吉丁蟲觸角AmalOBPs、AmalCSPs、基因分別與其它鞘翅目昆蟲序列聚類到不同的分枝,說(shuō)明在進(jìn)化過(guò)程中較分化;共同受體AmalORco、AmalIR8a和AmalIR25a以及AmalSNMP1基因分別與其它鞘翅目昆蟲序列聚類到同一分枝,表現(xiàn)出進(jìn)化過(guò)程中的高度保守性。蘋果小吉丁蟲觸角中共鑒定到11條OBP基因,全部具有完整的開(kāi)放閱讀框,編碼132~149個(gè)氨基酸,序列N端分布有16~20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。其中5條基因序列中包含6個(gè)保守的的半胱氨酸,屬于“Classic OBP”亞族,分別為AmalOBP1,AmalOBP2,AmalOBP3,AmalOBP4,AmalOBP5;5條基因序列中包含4個(gè)半胱氨酸,與“Classic OBP”相比缺少第2和第5位的半胱氨酸,屬于“Minus-C OBP”亞族,分別為AmalOBP7,AmalOBP8,AmalOBP9,AmalOBP10,AmalOBP11;AmalOBP6屬于“Plus-C OBP”亞族,序列中含有8個(gè)保守的半胱氨酸,并在第六個(gè)半胱氨酸后緊接一個(gè)脯氨酸。蘋果小吉丁蟲觸角中共鑒定到8條CSP基因,除了AmalCSP7在3′端缺失部分堿基不完整,其余7條均具有完整的開(kāi)放閱讀框,編碼119~137個(gè)氨基酸,在N端具有16~22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。熒光定量PCR結(jié)果表明AmalOBP1、AmalOBP2、AmalOBP3、AmalOBP4、AmalOBP6和AmalOBP7這6條基因在雌、雄蟲觸角中特異性或高豐度表達(dá),但在頭、胸、腹、足和翅中表達(dá)量很低,表明它們可能執(zhí)行嗅覺(jué)反應(yīng)功能。有3條基因(即AmalOBP5,AmalOBP8和AmalOBP9)不僅在雌、雄蟲觸角中有較高的表達(dá)量,而且在成蟲腹部和翅中也表現(xiàn)較高的表達(dá)水平,說(shuō)明它們?cè)趨⑴c嗅覺(jué)識(shí)別過(guò)程的同時(shí),也參與到其它的生理過(guò)程。AmalOBP10和AmalOBP11分別在雄蟲和雌蟲腹部特異性地表達(dá),表明它們可能與成蟲感受和釋放信息素的生理過(guò)程有關(guān)。AmalCSP2和AmalCSP3均在雌、雄觸角中特異性表達(dá),表明它們可能識(shí)別氣味物質(zhì),參與成蟲嗅覺(jué)反應(yīng)過(guò)程。通過(guò)對(duì)蘋果小吉丁蟲觸角中表達(dá)量較高的4條OBP和2條CSP基因進(jìn)行原核表達(dá),發(fā)現(xiàn)這6個(gè)蛋白均以包涵體的形式表達(dá)。通過(guò)對(duì)重組蛋白包涵體稀釋復(fù)性,利用Ni離子親和層析柱純化重組蛋白,獲得了高純度的目的蛋白。蛋白印記雜交分析表明純化后的重組蛋白在14~17 KDa左右出現(xiàn)明顯的單一目的條帶,說(shuō)明目的蛋白純化質(zhì)量高。采用BCA方法測(cè)得純化后的目的蛋白AmalOBP1、AmalOBP3、AmalOBP7、AmalOBP8、AmalCSP2和AmalCSP3的質(zhì)量濃度分別為1.28、1.53、0.61、0.58、0.90和1.12 mg/mL。利用GraphPad Prism 5軟件對(duì)重組蛋白與熒光探針1-NPN結(jié)合產(chǎn)生的最大熒光強(qiáng)度值進(jìn)行非線性回歸擬合,測(cè)得重組蛋白AmalOBP1、AmalOBP3、AmalOBP7、AmalOBP8、AmalCSP2和AmalCSP3的結(jié)合常數(shù)(K_d)分別為1.17、8.63、4.52、4.69、8.87和8.10μM。熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果表明AmalOBP1和AmalOBP7對(duì)寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合譜較窄,AmalOBP1僅能結(jié)合法尼醇(K_i=23.27±0.06μM)、2,4-癸二烯酸乙酯(K_i=35.54±0.22μM)、己酸葉醇酯(K_i=36.67±0.21μM)和莰烯(K_i=35.36±0.06μM);AmalOBP7對(duì)十二醇(K_i=14.94±0.36μM)、法尼醇(K_i=21.60±0.35μM)和十二醛(K_i=14.46±0.21μM)表現(xiàn)出較高的結(jié)合能力,也能結(jié)合α-羅勒烯(Ki=32.28±0.26μM)。AmalOBP3和AmalOBP8能廣譜地結(jié)合15和22種化合物,包括醇、醛、酯和萜類物質(zhì),不結(jié)合烯烴和烷烴類物質(zhì)。AmalOBP3和AmalOBP8均能強(qiáng)烈地結(jié)合主鏈碳原子數(shù)在C12-15的十二醇、十四醇、橙花叔醇和法尼醇(K_i?6μM);它們對(duì)主鏈碳原子數(shù)在C10-12的乙酸辛酯、甲酸香葉酯、桃醛、2,4-癸二烯酸乙酯和己酸葉醇酯也表現(xiàn)出很強(qiáng)的結(jié)合能力(K_i=7.09~31.90μM)。此外,AmalOBP3和Amal OBP8均對(duì)(4E,6Z)-2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯和α-羅勒烯(K_i=7.72~15.71μM)表現(xiàn)很強(qiáng)的結(jié)合能力。AmalCSP2和AmalCSP3分別能選擇性的結(jié)合9和7種化合物(K_i?40μM),其中AmalCSP3對(duì)十四醇(K_i=1.52±0.01μM)具有特別強(qiáng)的結(jié)合能力。以上結(jié)果表明這6條基因均能識(shí)別寄主植物揮發(fā)物組分,共同參與到成蟲對(duì)寄主揮發(fā)物的嗅覺(jué)反應(yīng)過(guò)程中。在23種與重組蛋白AmalOBPs和AmalCSPs結(jié)合效果較好的寄主植物揮發(fā)物中,雌蟲對(duì)癸醛、甲酸香葉酯、2,4-癸二烯酸乙酯、己酸葉醇酯和(4E,6Z)-2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯,雄蟲對(duì)法尼醇、癸醛和己酸葉醇酯表現(xiàn)強(qiáng)烈的觸角電位反應(yīng),EAG相對(duì)值均大于1.0。雙向嗅覺(jué)行為試驗(yàn)表明(4E,6Z)-2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯、甲酸香葉酯、己酸葉醇酯、癸醛和十四醇對(duì)雌蟲具有顯著的吸引效果,己酸葉醇酯對(duì)雄蟲表現(xiàn)出強(qiáng)烈的吸引作用,其它物質(zhì)均不能引起雄蟲明顯的行為反應(yīng),表明以上幾種氣味化合物在成蟲選擇合適的寄主植物取食和產(chǎn)卵過(guò)程中發(fā)揮重要作用。田間誘捕試驗(yàn)表明雌、雄蟲均對(duì)黃色誘蟲板的趨性最強(qiáng),每個(gè)誘捕器10天誘捕量為雌蟲14.33±1.09頭、雄蟲5.67±1.52頭和總蟲數(shù)20.00±2.57頭,其次為綠色,雌蟲11.67±0.88頭、雄蟲5.33±0.72頭和總蟲數(shù)17.00±1.16頭,這兩種顏色均適合用于田間誘捕試驗(yàn)。此外,癸醛對(duì)雌、雄成蟲具有良好的誘捕效果,每個(gè)誘捕器10天的誘捕量為雌蟲14.00±1.53頭、雄蟲7.00±1.53頭和總蟲數(shù)21.00±2.00頭。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S433
【圖文】：

圖 1-1 昆蟲識(shí)別和感受氣味物質(zhì)的機(jī)制（Sanchez-Gracia et al. 2009）Fig. 1-1 Schematic view of the odorant perception process in insects（Sanchez-Gracia et al. 2009 昆蟲嗅覺(jué)相關(guān)基因研究1 昆蟲觸角基因組和轉(zhuǎn)錄組研究昆蟲的不同物種生物學(xué)特性差異很大，基因組包含的信息也存在巨大差異，僅昆蟲的基因組信息對(duì)深入研究和解釋其它物種的表型差異存在困難（張傳溪 生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，基因組測(cè)序成本大大降低，近年來(lái)多種昆蟲的基序，通過(guò)分析能夠獲得比較全面的嗅覺(jué)相關(guān)基因信息。如雙翅目的黑腹rosophilamelanogaster）（Hekmat-Scafeetal.2002）和岡比亞按蚊（Anophelesgamuetal.2003）、鱗翅目的家蠶（Bombyxmori）（Gongetal.2009）、蜚蠊目的美洲eriplaneta americana）（Li et al. 2018）、半翅目的豌豆蚜（Zhou et al. 2010）、膜大利蜜蜂（Apis melifera）（Robertson and Wanner 2006）以及鞘翅目的赤擬ribolium castaneum）（Richards et al. 2008）、光肩星天牛（Anolophora glabripencKennaetal.2016）、大紅埋葬甲（NicrophorusVespilloides）（Cunninghametal.20

圖 1-2 昆蟲氣味結(jié)合蛋白與氣味配體的熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合示意圖（Zhuang et al. 2013）. 1-2 Schematic representation of competitive binding assays beween OBP proteins and odour ligusing a fluorescent probe（Zhuang et al. 2013）在觸角中大量表達(dá)的 OBPs 通常能夠識(shí)別和結(jié)合寄主植物揮發(fā)物或昆蟲性信昆蟲的嗅覺(jué)反應(yīng)過(guò)程。棉鈴蟲 HarmPBP1 能強(qiáng)烈結(jié)合信息素組分順-11-碳烯醛烯醛，蛋白三維結(jié)構(gòu)和分子柔性對(duì)接分析表明關(guān)鍵性結(jié)合位點(diǎn)分別是 Ser9、Tr36、Phe119 和 Thr112、Lys111、Phe119（Zhang et al. 2012）。桔小實(shí)蠅 BdorOB和多種引誘劑結(jié)合，在調(diào)節(jié)害蟲趨性方面具有重要作用（Wu et al. 2016）；棗sOBP3 能強(qiáng)烈結(jié)合性信息素 α-法尼烯，CvesOBP2 能結(jié)合乙酸順-3-己烯酯，CvesvesOBP4 能結(jié)合棗果實(shí)釋放的揮發(fā)物組分石竹烯和花柏烯（Li et al. 2017）。苜AlinOBP6 在雌蟲觸角的錐形和刺形感器中特異性表達(dá)，能夠結(jié)合寄主揮發(fā)物組發(fā)性酚類物質(zhì)，在成蟲嗅覺(jué)和味覺(jué)反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用（Sun et al. 2017）。巢（Megouraviciae）MvicOBP3均能結(jié)合 (E)-β-farnesene、α-pinene、β-pinene和lim報(bào)警信息素，蛋白結(jié)構(gòu)中的芳香族殘基與氣味配體形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵能促進(jìn)兩（Northey et al. 2016）。美洲大蠊 PmacOBP24 在雌、雄觸角中均特異性表達(dá)，

圖 2-1 蘋果小吉丁蟲對(duì)四種植物的選擇著落數(shù)量. 2-1 The number of Agrilus mali adults observed on foliage of four test p丁蟲對(duì)四種植物葉片的取食量 4 種植物的不同大小的葉片面積（cm2）和重量（g），建立分別為：海棠 Y=0.0141X+0.0198，R2=0.95；蘋果 Y=0.0Y=0.0300X-0.0979，R2=0.95；桃 Y=0.0249X-0.0173，R2=0.的單位葉片重量，發(fā)現(xiàn)蘋果（0.0240 g/cm2）和桃（0.0232 ，兩者之間無(wú)顯著差別（P>0.05），但它們均顯著大于海棠（P=0.022，海棠 vs 蘋果 P=0.007）；梨（0.0214g/cm2）的單位間差異不顯著（P > 0.05）（圖 2-2B）。

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 陳秀琳;梨小食心蟲嗅覺(jué)相關(guān)基因的功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2746376