發(fā)布時(shí)間：2020-07-08 11:53

【摘要】：為建立一種新的外源蛋白安全評(píng)估方法,構(gòu)建轉(zhuǎn)外源基因酵母是關(guān)鍵步驟。本研究以來源于轉(zhuǎn)基因作物的抗除草劑合成酶蛋白CP4-EPSPS為研究模板,首先通過基因優(yōu)化和化學(xué)合成獲得cp4-epsps基因,優(yōu)化后基因密碼子適用性指數(shù)(CAI)為0.85,GC含量為52%。目的基因克隆至畢赤酵母表達(dá)載體p PICZb,經(jīng)鑒定篩選正確的重組載體p PICZb-EPSPS電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115,cp4-epsps基因通過同源重組方式整合至酵母基因組,PCR擴(kuò)增酵母基因組篩選得到在正確位點(diǎn)發(fā)生同源重組的4株陽性菌株。隨后,各陽性菌株分別于28℃、250~300 r/min培養(yǎng),0.5%甲醇誘導(dǎo)4 d后,提取各組菌株總蛋白,采用SDS-PAGE和western blotting鑒定CP4-EPSPS表達(dá)的正確性。CP4-EPSPS單克隆抗體及載體標(biāo)簽C-MYC單克隆抗體的western blotting結(jié)果一致顯示cp4-epsps基因在畢赤酵母GS115中成功獲得表達(dá),大小約50 ku。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)cp4-epsps基因的畢赤酵母基因工程菌,為下一步開展轉(zhuǎn)基因作物CP4-EPSPS成份的安全評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

加等體積2×SDS上樣緩沖液煮沸，待蛋白電泳。1.2.5CP4-EPSPS蛋白的westernblotting鑒定采用SDS-PAGE分離蛋白樣品，同時(shí)PVDF膜采用甲醇預(yù)處理3~5s，放至轉(zhuǎn)印液浸潤(rùn)半小時(shí)。電泳結(jié)束后取出凝膠，通過電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，低溫操作，100V恒壓60~120min，取出雜交膜，TBST漂洗5min三次，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1h，TBST洗膜三次，加入CP4-EPSPS單克隆抗體(1:500)4℃過夜，TBST洗膜三次，Rabbitanti-mouseIgG-HRP(1:5000)稀釋液37℃孵育1h，TBST洗膜，放至暗盒，顯影。2結(jié)果與分析2.1pPICZb-EPSPS重組載體構(gòu)建圖1pPICZb-EPSPS重組載體構(gòu)建流程圖Fig.1TheconstructionofpPICZb-EPSPSvector圖1為pPICZb-EPSPS重組載體構(gòu)建流程圖。其中化學(xué)合成的cp4-epsps基因首先克隆在pUC57載體上。pPICZb載體大小為3328bp，載體上SfuI和XbaI位點(diǎn)為cp4-epsps基因的同源重組位點(diǎn)，HindIII和EcoRV位點(diǎn)為pPICZb-EPSPS重組載體的鑒定位點(diǎn)。2.2cp4-epsps基因的優(yōu)化及擴(kuò)增為提高mRNA的穩(wěn)定性及蛋白表達(dá)效率[24,25]，須根據(jù)畢赤酵母細(xì)胞Pichiapastoris的偏好性進(jìn)行cp4-epsps基因密碼子優(yōu)化，減小稀有密碼子的使用，提高最優(yōu)密碼子在基因序列中的比例，同時(shí)使基因的GC含量保持在30~70%之間，豐富的GC含量可大大提高該基因的表達(dá)水平[26]，低水平GC含量將限制基因轉(zhuǎn)錄[26,27]�；騼�(yōu)化結(jié)果見圖2和圖3，優(yōu)化序列見附件1。

現(xiàn)代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2017,Vol.33,No.1158圖2密碼子適用性指數(shù)Fig.2CodonAdaptationIndexes(CAI)注：該圖為基因序列各密碼子的利用率分布圖。一般認(rèn)為當(dāng)CAI為1.0時(shí)，基因表達(dá)水平最為理想，CAI值越高，其表達(dá)水平越高。圖3不同利用率密碼子在基因中的百分含量Fig.3FrequencyofOptimalCodons(FOP)圖2為基因序列中各密碼子的利用率分布圖，由密碼子適用性指數(shù)（Codonadaptionindex，CAI）表征。通常認(rèn)為，當(dāng)CAI為1.0時(shí)，是菌株表達(dá)最理想狀態(tài)，其表達(dá)水平最高，當(dāng)CAI>0.9時(shí)，表達(dá)水平理想。圖2結(jié)果所示，序列經(jīng)優(yōu)化后，其CAI值由0.77增加至0.85，表明理論表達(dá)水平將得到提高。圖3為不同利用率密碼子的百分含量。由圖可知，原始序列中利用率在90~100%的密碼子所占比例約50%，序列經(jīng)優(yōu)化后，所占比例大于55%，提高了利用率在90~100%的密碼子的含量，同時(shí)利用率在70~80%，60~70%和50~60%的密碼子的含量相應(yīng)提高。序列經(jīng)優(yōu)化后，大大降低了稀有密碼子的比例。研究表明[25]當(dāng)最優(yōu)密碼子含量低于40%時(shí)，mRNA的平均半衰期為5.4min，當(dāng)最優(yōu)密碼子含量高于70%時(shí)，mRNA的平均半衰期為17.8min，可見密碼子的優(yōu)化對(duì)穩(wěn)定mRNA有重要作用。經(jīng)過優(yōu)化，序列中平均GC含量由最初49%提高至52%。KudlaG等[26]研究比較了同一基因GC豐富序列和GC貧乏序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GC含量豐富的序列更易進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄或mRNA的加工處理，GC含量豐富的序列通過提高mRNA的穩(wěn)定性從而提高基因的表達(dá)水平。在基因優(yōu)化過程中同時(shí)還去除A/T或G/C重復(fù)序列，避免mRNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它特殊結(jié)構(gòu)，防止mRNA過早終止翻譯[28,29]。最后，基于GenbankKP212901.1cp4-epsps基因序列(1368bp)，GS115菌株偏好性和載體要?

現(xiàn)代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2017,Vol.33,No.1158圖2密碼子適用性指數(shù)Fig.2CodonAdaptationIndexes(CAI)注：該圖為基因序列各密碼子的利用率分布圖。一般認(rèn)為當(dāng)CAI為1.0時(shí)，基因表達(dá)水平最為理想，CAI值越高，其表達(dá)水平越高。圖3不同利用率密碼子在基因中的百分含量Fig.3FrequencyofOptimalCodons(FOP)圖2為基因序列中各密碼子的利用率分布圖，由密碼子適用性指數(shù)（Codonadaptionindex，CAI）表征。通常認(rèn)為，當(dāng)CAI為1.0時(shí)，是菌株表達(dá)最理想狀態(tài)，其表達(dá)水平最高，當(dāng)CAI>0.9時(shí)，表達(dá)水平理想。圖2結(jié)果所示，序列經(jīng)優(yōu)化后，其CAI值由0.77增加至0.85，表明理論表達(dá)水平將得到提高。圖3為不同利用率密碼子的百分含量。由圖可知，原始序列中利用率在90~100%的密碼子所占比例約50%，序列經(jīng)優(yōu)化后，所占比例大于55%，提高了利用率在90~100%的密碼子的含量，同時(shí)利用率在70~80%，60~70%和50~60%的密碼子的含量相應(yīng)提高。序列經(jīng)優(yōu)化后，大大降低了稀有密碼子的比例。研究表明[25]當(dāng)最優(yōu)密碼子含量低于40%時(shí)，mRNA的平均半衰期為5.4min，當(dāng)最優(yōu)密碼子含量高于70%時(shí)，mRNA的平均半衰期為17.8min，可見密碼子的優(yōu)化對(duì)穩(wěn)定mRNA有重要作用。經(jīng)過優(yōu)化，序列中平均GC含量由最初49%提高至52%。KudlaG等[26]研究比較了同一基因GC豐富序列和GC貧乏序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GC含量豐富的序列更易進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄或mRNA的加工處理，GC含量豐富的序列通過提高mRNA的穩(wěn)定性從而提高基因的表達(dá)水平。在基因優(yōu)化過程中同時(shí)還去除A/T或G/C重復(fù)序列，避免mRNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它特殊結(jié)構(gòu)，防止mRNA過早終止翻譯[28,29]。最后，基于GenbankKP212901.1cp4-epsps基因序列(1368bp)，GS115菌株偏好性和載體要?

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