cp4-epsps基因在畢赤酵母中的表達及鑒定
【圖文】：
加等體積2×SDS上樣緩沖液煮沸，待蛋白電泳。1.2.5CP4-EPSPS蛋白的westernblotting鑒定采用SDS-PAGE分離蛋白樣品，同時PVDF膜采用甲醇預處理3~5s，放至轉(zhuǎn)印液浸潤半小時。電泳結(jié)束后取出凝膠，通過電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，低溫操作，100V恒壓60~120min，取出雜交膜，TBST漂洗5min三次，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1h，TBST洗膜三次，加入CP4-EPSPS單克隆抗體(1:500)4℃過夜，TBST洗膜三次，Rabbitanti-mouseIgG-HRP(1:5000)稀釋液37℃孵育1h，TBST洗膜，放至暗盒，顯影。2結(jié)果與分析2.1pPICZb-EPSPS重組載體構(gòu)建圖1pPICZb-EPSPS重組載體構(gòu)建流程圖Fig.1TheconstructionofpPICZb-EPSPSvector圖1為pPICZb-EPSPS重組載體構(gòu)建流程圖。其中化學合成的cp4-epsps基因首先克隆在pUC57載體上。pPICZb載體大小為3328bp，載體上SfuI和XbaI位點為cp4-epsps基因的同源重組位點，HindIII和EcoRV位點為pPICZb-EPSPS重組載體的鑒定位點。2.2cp4-epsps基因的優(yōu)化及擴增為提高mRNA的穩(wěn)定性及蛋白表達效率[24,25]，須根據(jù)畢赤酵母細胞Pichiapastoris的偏好性進行cp4-epsps基因密碼子優(yōu)化，減小稀有密碼子的使用，提高最優(yōu)密碼子在基因序列中的比例，同時使基因的GC含量保持在30~70%之間，豐富的GC含量可大大提高該基因的表達水平[26]，低水平GC含量將限制基因轉(zhuǎn)錄[26,27]�；騼�(yōu)化結(jié)果見圖2和圖3，優(yōu)化序列見附件1。
現(xiàn)代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2017,Vol.33,No.1158圖2密碼子適用性指數(shù)Fig.2CodonAdaptationIndexes(CAI)注：該圖為基因序列各密碼子的利用率分布圖。一般認為當CAI為1.0時，基因表達水平最為理想，CAI值越高，其表達水平越高。圖3不同利用率密碼子在基因中的百分含量Fig.3FrequencyofOptimalCodons(FOP)圖2為基因序列中各密碼子的利用率分布圖，由密碼子適用性指數(shù)（Codonadaptionindex，CAI）表征。通常認為，當CAI為1.0時，是菌株表達最理想狀態(tài)，其表達水平最高，當CAI>0.9時，表達水平理想。圖2結(jié)果所示，序列經(jīng)優(yōu)化后，其CAI值由0.77增加至0.85，表明理論表達水平將得到提高。圖3為不同利用率密碼子的百分含量。由圖可知，原始序列中利用率在90~100%的密碼子所占比例約50%，序列經(jīng)優(yōu)化后，所占比例大于55%，提高了利用率在90~100%的密碼子的含量，同時利用率在70~80%，60~70%和50~60%的密碼子的含量相應提高。序列經(jīng)優(yōu)化后，大大降低了稀有密碼子的比例。研究表明[25]當最優(yōu)密碼子含量低于40%時，mRNA的平均半衰期為5.4min，當最優(yōu)密碼子含量高于70%時，mRNA的平均半衰期為17.8min，可見密碼子的優(yōu)化對穩(wěn)定mRNA有重要作用。經(jīng)過優(yōu)化，序列中平均GC含量由最初49%提高至52%。KudlaG等[26]研究比較了同一基因GC豐富序列和GC貧乏序列在哺乳動物細胞中的表達情況，發(fā)現(xiàn)GC含量豐富的序列更易進行有效的轉(zhuǎn)錄或mRNA的加工處理，GC含量豐富的序列通過提高mRNA的穩(wěn)定性從而提高基因的表達水平。在基因優(yōu)化過程中同時還去除A/T或G/C重復序列，避免mRNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它特殊結(jié)構(gòu)，防止mRNA過早終止翻譯[28,29]。最后，基于GenbankKP212901.1cp4-epsps基因序列(1368bp)，GS115菌株偏好性和載體要?
現(xiàn)代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2017,Vol.33,No.1158圖2密碼子適用性指數(shù)Fig.2CodonAdaptationIndexes(CAI)注：該圖為基因序列各密碼子的利用率分布圖。一般認為當CAI為1.0時，基因表達水平最為理想，CAI值越高，其表達水平越高。圖3不同利用率密碼子在基因中的百分含量Fig.3FrequencyofOptimalCodons(FOP)圖2為基因序列中各密碼子的利用率分布圖，由密碼子適用性指數(shù)（Codonadaptionindex，CAI）表征。通常認為，當CAI為1.0時，是菌株表達最理想狀態(tài)，其表達水平最高，當CAI>0.9時，表達水平理想。圖2結(jié)果所示，序列經(jīng)優(yōu)化后，其CAI值由0.77增加至0.85，表明理論表達水平將得到提高。圖3為不同利用率密碼子的百分含量。由圖可知，原始序列中利用率在90~100%的密碼子所占比例約50%，序列經(jīng)優(yōu)化后，所占比例大于55%，提高了利用率在90~100%的密碼子的含量，同時利用率在70~80%，60~70%和50~60%的密碼子的含量相應提高。序列經(jīng)優(yōu)化后，大大降低了稀有密碼子的比例。研究表明[25]當最優(yōu)密碼子含量低于40%時，mRNA的平均半衰期為5.4min，當最優(yōu)密碼子含量高于70%時，mRNA的平均半衰期為17.8min，可見密碼子的優(yōu)化對穩(wěn)定mRNA有重要作用。經(jīng)過優(yōu)化，序列中平均GC含量由最初49%提高至52%。KudlaG等[26]研究比較了同一基因GC豐富序列和GC貧乏序列在哺乳動物細胞中的表達情況，發(fā)現(xiàn)GC含量豐富的序列更易進行有效的轉(zhuǎn)錄或mRNA的加工處理，GC含量豐富的序列通過提高mRNA的穩(wěn)定性從而提高基因的表達水平。在基因優(yōu)化過程中同時還去除A/T或G/C重復序列，避免mRNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它特殊結(jié)構(gòu)，防止mRNA過早終止翻譯[28,29]。最后，基于GenbankKP212901.1cp4-epsps基因序列(1368bp)，GS115菌株偏好性和載體要?
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本文編號：2746502
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