【摘要】：甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)是世界上主要的油料作物之一。相比于其他油料作物,其種植面積廣泛且產(chǎn)油效率較高。但是,我國甘藍(lán)型油菜的生產(chǎn)還面臨著品種之間品質(zhì)差異大,產(chǎn)油量受環(huán)境影響大的挑戰(zhàn)。因此,培育和研究高含油量,以及抗逆的油菜品種具有重要的意義。在本課題組前期對(duì)高含油量和低含油量甘藍(lán)型油菜的蛋白質(zhì)組學(xué)和比較基因組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),LEA(late embryogenesis abundant)蛋白和VOC(vicinal oxygen chelate)蛋白在高含油量的油菜種子大量存在,說明它們可能對(duì)油菜的油脂積累有一定的作用。其中,LEA是高等植物胚胎發(fā)育晚期大量積累的一類蛋白,主要在植物抗非生物脅迫中發(fā)揮作用。VOC基因?qū)儆卩徰躜辖饘倜赋易?參與催化多種生物學(xué)反應(yīng)。雖然LEA和VOC基因家族在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中有相關(guān)鑒定工作,但是在甘藍(lán)型油菜中的全基因水平鑒定尚未報(bào)道,并且目前缺乏對(duì)其在非生物脅迫以及油脂合成代謝方面的相關(guān)研究。本研究針對(duì)此兩個(gè)基因家族,結(jié)合生物信息學(xué),分子生物學(xué),以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,在甘藍(lán)型油菜全基因組水平鑒定了此兩個(gè)基因家族,并對(duì)其在干旱脅迫響應(yīng),油脂合成方面發(fā)揮的功能、作用機(jī)理進(jìn)行研究,取得的主要研究成果如下:(1)本研究首先通過生物信息學(xué)手段,在甘藍(lán)型油菜全基因組水平對(duì)LEA基因家族進(jìn)行鑒定,共鑒定出108個(gè)BnLEA基因,分為8個(gè)亞家族。對(duì)此基因家族成員的結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)其存在內(nèi)含子少,含有5-10個(gè)motif的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。共線性和進(jìn)化分析表明,接近三分之二的BnLEA與片段化復(fù)制事件相關(guān)。LEA基因在甘藍(lán)型油菜基因組中擴(kuò)張和成簇主要是由于祖先基因的全基因組復(fù)制(WGD),最后伴隨著隨機(jī)復(fù)制事件與片段化復(fù)制事件而形成。采用實(shí)時(shí)熒光定量的方法(qRT-PCR)對(duì)甘藍(lán)型油菜不同組織的LEA基因表達(dá)量進(jìn)行探究,結(jié)果表明不同的亞家族表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式,而系統(tǒng)進(jìn)化成對(duì)的基因表現(xiàn)出類似的表達(dá)模式,大部分BnLEA基因在晚期發(fā)育的果莢(播種四十周后)和葉片中的存在較高的表達(dá)量。(2)利用擬南芥的同源基因,在甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫中,鑒定出VOC家族成員38個(gè),其中,分為乙二醛酶I亞家族(glyoxalase I,GLY I)和4-羥基苯丙酮酸加雙氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPPD)亞家族。結(jié)構(gòu)分析表明,大部分BnaVOC基因有2或3個(gè)內(nèi)含子,BnaGLYI金屬離子中心預(yù)測(cè)結(jié)果為螯合鋅離子,而BnaHPPD金屬離子中心預(yù)測(cè)螯合鐵離子。共線性和進(jìn)化分析結(jié)果表明,大部分的BnaVOC的祖先基因來源于擬南芥1號(hào)染色體的基因簇,并且此家族是蕓薹屬植物進(jìn)化過程中的不均一多倍化事件(mesopolyploidy events)作用后的產(chǎn)物。全基因組復(fù)制事件和片段化復(fù)制對(duì)其擴(kuò)張起主要作用。對(duì)甘藍(lán)型油菜的各個(gè)組織,以及不同干旱處理時(shí)期的甘藍(lán)型油菜種子進(jìn)行表達(dá)譜分析,相比其他組織,在葉片和晚期發(fā)育的果莢(播種30周后)中,大部分的VOC家族成員的表達(dá)量較高。在干旱脅迫的情況下,相比于低含油量的油菜果莢,高含油量的油菜果莢中,大部分VOC家族成員的基因表達(dá)量較高。(3)利用分子生物學(xué)手段,對(duì)4個(gè)BnLEA3基因,4個(gè)BnVOC基因,以及擬南芥同源的AtLEA3基因,AtVOC基因,共10個(gè)基因進(jìn)行克隆。分別構(gòu)建種子特異表達(dá)啟動(dòng)子和35S啟動(dòng)子的超表達(dá)載體,其中,AtVOC基因還構(gòu)建35S啟動(dòng)子的RNA干擾載體(AtVOC-RNAi),并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。同時(shí),購入AtLEA3基因突變體(atlea3),并克隆AtLEA基因全長,并構(gòu)建AtLEA基因的1305互補(bǔ)載體,轉(zhuǎn)化atlea3突變體。對(duì)轉(zhuǎn)基因和突變體種子的含油量,脂肪酸組分,千粒重,種子大小進(jìn)行分析,以及對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行干旱脅迫處理,并對(duì)其表型進(jìn)行觀察。相對(duì)于對(duì)照,超表達(dá)BnLEA3基因以及BnVOC基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因后代種子含油量提高15%-23%,脂肪酸組分發(fā)生相應(yīng)變化,千粒重提高17%-30%,不同拷貝的BnLEA3基因和BnVOC基因的表現(xiàn)不同。干旱脅迫下,超表達(dá)株系相比于野生型,具有更高的葉綠素含量、相對(duì)含水量和葉表溫度,較低的花青素含量,體現(xiàn)出更強(qiáng)的抗逆性。而atlea3突變體和atvoc-rnai干擾株系體現(xiàn)出低水平的抗干旱性。轉(zhuǎn)入互補(bǔ)載體后對(duì)atlea3突變體表型恢復(fù)。(4)利用RNA-seq技術(shù)對(duì)長期干旱處理與短期干旱處理的BnLEA-OE,BnVOC-OE,AtLEA-OE,AtVOC-OE,atlea3突變體,AtVOC-RNAi,以及WT株系的果莢,葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析。與WT相比,在短期干旱處理的LEA系列種子中,AtLEA-OE,BnLEA-OE,atlea3突變體分別有1676,2707,695個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)。在LEA系列長期干旱處理的種子中,AtLEA-OE,BnLEA-OE,atlea3突變體分別有80,638,7個(gè)DEGs。GO富集和KEGG富集結(jié)果表明,不同株系的種子主要是在油脂合成,油脂消減代謝途徑存在顯著性差異。葉片中,主要是在光合作用,葉綠素合成,碳固定,植物激素信號(hào)傳導(dǎo),以及乙醛酸代謝中存在顯著差異。最后,利用q-RTPCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示差異趨勢(shì)一致。(5)將含有不同基因拷貝的超表達(dá)和RNA干擾(BnLEA3-OE,BnVOC-OE,BnLEA-RNAi,BnVOC-RNAi)載體轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜(Westar)。對(duì)轉(zhuǎn)基因后代的種子進(jìn)行分析,相比于野生型,OE株系的含油量提高11.8%-23.6%,RNAi株系的含油量降低13.1%-18.4%。同時(shí)OE株系種子變大,千粒重提高,而RNAi株系種子變小,千粒重下降。干旱脅迫后,超表達(dá)株系具有更強(qiáng)的抗干旱能力,同時(shí)其種子含油量受干旱影響小。而RNAi株系則擁有更弱的抗干旱能力。(6)針對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜的含油量的提高以及抗干旱性能的增強(qiáng),將LEA與VOC的對(duì)應(yīng)超表達(dá)和RNAi株系進(jìn)行雜交,對(duì)雜交后代進(jìn)行分析。并對(duì)干旱處理下的LEA系列的光合效率,VOC系列氧化還原系統(tǒng)的對(duì)應(yīng)物質(zhì)含量和酶活水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,相比于單基因超表達(dá)株系,超表達(dá)株系的雜交后代的抗逆性能提升,并且含油量提高,RNAi雜交后代的抗旱性和含油量均下降。在干旱脅迫下,LEA基因可以有效幫助植株提高光合效率,VOC基因則降低了超氧化物和甲基乙二醛的積累,從而發(fā)揮抗干旱的功能。綜上所述,甘藍(lán)型油菜和擬南芥的LEA3和VOC基因不僅可以在干旱脅迫中發(fā)揮功能,提高光合效率,穩(wěn)定細(xì)胞發(fā)育,還可以在油脂代謝中起作用,主要通過增強(qiáng)油脂的合成,降低油脂消減,降低活性氧對(duì)細(xì)胞的毒害作用,保證種子在干旱脅迫下的正常發(fā)育,從而實(shí)現(xiàn)含油量的提高。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S565.4
【圖文】：

6 植物中脂肪酸和三酰基甘油的合成途徑[41]（左邊質(zhì)體中為自由脂肪酸的合成過程中為 TAG 的組裝過程。關(guān)鍵物質(zhì)：蔗糖、丙酮酸、乙酰輔酶 A、丙二酰輔酶 A、酶 A、溶血磷脂酸、磷脂酸、甘油二酯） 1.1 Fatty acid and TAG production in plants[41](Left: Free FA synthesis process in plasti production in endoplasmic reticulum. Key components: sucrose, pyruvate, acetyl CoA, mCoA, acyl CoA, lysophosphatidic acid, phosphatidic acid, diacylglycerol)植物油脂的降解于植物種子而言，油脂是能量的儲(chǔ)存形式，也需要在種子萌發(fā)，生長需，從而提供能量。TAG 首先在脂肪酶的作用下，降解為甘油與游離的脂脂肪酸可以被 β-氧化。每一次 β-氧化需要經(jīng)過脫氫，水合，再脫氫，，在脂酰 CoA 脫氫酶、烯脂酰 CoA 水化酶、羥脂酰 CoA 脫氫酶以及硫解酶的催化下完成，最終形成乙酰 CoA 和脂酰 CoA[41]。

圖 2.1 多個(gè)物種 LEA 基因家族成員分布解析圖（左側(cè)為物種之間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，從低等植物，如藻類到高等單雙子葉植物；右側(cè)表格為 LEA家族的 8 個(gè)亞家族在各個(gè)物種中的數(shù)目分布）Figure 2.1 Distribution analysis of LEA genes in different plant species (Left: Phylogenetic relationship of different plant species, including lowerplants, such as algae and higher plants, such as eudicots and monocots; Right: The sheet show detail numbers of members in each LEA subfamilies inthese plant species)

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文 BnLEA 基因家族的序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析108 個(gè) BnLEA 基因全部進(jìn)行多序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖 2.2示，八個(gè)亞家族之間相似性程度不高，共形成八個(gè)主要的分枝。LEA_6 的性最強(qiáng)。LEA_1 與 LEA_6 雖然存在不同的保守結(jié)構(gòu)域，但是其序列在系統(tǒng)中的關(guān)系更近。此現(xiàn)象還發(fā)生在 BnLEA14，此基因的結(jié)構(gòu)域?qū)儆?LEA_4 亞其在進(jìn)化上卻與 LEA_5 亞家族更接近。大部分的 BnLEA 基因出現(xiàn)成對(duì)現(xiàn)象（Gene pairs）。其中，40 對(duì)成對(duì)基因有舉值（100%）。其余 3 對(duì)成對(duì)基因也具有相對(duì)較高的自舉值，達(dá)到 90%-9分的基因?qū)τ休^短的分枝長度，說明其分化在進(jìn)化上發(fā)生的時(shí)間不長。以明了在進(jìn)化過程中，大部分 BnLEA 基因是保守的，可是還是存在個(gè)別的分高的現(xiàn)象。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 官春云;;中國油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向[J];糧食科技與經(jīng)濟(jì);2011年02期

2 殷艷;王漢中;;我國油菜生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J];農(nóng)業(yè)展望;2011年01期

3 王漢中;;我國油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的歷史回顧與展望[J];中國油料作物學(xué)報(bào);2010年02期

本文編號(hào)：2745075