【摘要】：NOD-樣受體(NOD-like receptors, NLR)是胞質(zhì)型模式識(shí)別受體(PRR),它同TLR、RLR等一樣,可以通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMP)而迅速啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng),并能通過(guò)NF-κB和MAPK等信號(hào)傳導(dǎo)途徑啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng),在機(jī)體的免疫防御過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。NOD1是NLR家族中最具代表性的一個(gè)成員,在先天性免疫中參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過(guò)程,也與一些炎癥性疾病的發(fā)生有關(guān)。研究報(bào)道,NLR家族在人有23個(gè)成員,在鼠至少有34個(gè)成員,但在禽類的研究報(bào)道很少,未見(jiàn)具體有多少成員的明確報(bào)道。目前,對(duì)于禽類的NOD1的研究尚處于起步階段,而雞是一種重要的模式動(dòng)物,同時(shí)也是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,因此,本研究以雞為研究對(duì)象,克隆雞NOD1基因的全長(zhǎng)cDNA序列,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；探查雞NOD1信號(hào)通路中NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11基因在組織中的表達(dá)情況；通過(guò)NOD1的特異性配體iE-DAP刺激HD11細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和RNA干擾實(shí)驗(yàn),探討雞NOD1基因?qū)ο掠涡盘?hào)分子及細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用；通過(guò)體內(nèi)和體外沙門(mén)氏菌感染實(shí)驗(yàn),探討雞NOD1信號(hào)通路在抗沙門(mén)氏菌感染過(guò)程中的作用。1.雞NOD1基因全長(zhǎng)cDNA克隆及生物信息學(xué)分析本研究通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR (Reverse transcription PCR)方法,3’和5’末端延伸技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)擴(kuò)增并獲得雞NOD1基因的全長(zhǎng)cDNA序列。該基因全長(zhǎng)cDNA為4502bp,包含124bp的5'UTR,2856bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)和1497bp的3'UTR,后接22bp的polyA尾巴。ORF finder分析表明,雞NOD1基因的開(kāi)放閱讀框位于125-2980區(qū)域,編碼一條含有951個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。采用ProtParam在線軟件進(jìn)行理化性質(zhì)分析,該蛋白質(zhì)分子量為108676.2Mr,理論等電點(diǎn)(PI)為6.58,總原子數(shù)為15308,分子式為：C4885H7669N1285O1421S48,不穩(wěn)定系數(shù)為36.77,總平均親水性為-0.160。經(jīng)預(yù)測(cè),雞NOD1蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)。通過(guò)NCBI在線BLSTn,將序列直接與雞基因組進(jìn)行比對(duì),該序列位于雞的2號(hào)染色體41824884-41845174位置,基因全長(zhǎng)20290bp。預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)果表明,雞NOD1蛋白由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,分別為N端的CARD、中間的NACHT以及C端的LRR結(jié)構(gòu)域,經(jīng)比較,與鴨、火雞、人、小鼠、魚(yú)的NOD1蛋白結(jié)構(gòu)域一致。利用ClustalW軟件進(jìn)行多序列比對(duì),并用MEGA軟件基于Poisson Correction模型構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù),表明雞NOD1蛋白與火雞親緣關(guān)系最近,與哺乳類動(dòng)物的親緣關(guān)系近于與魚(yú)類動(dòng)物的。2. Real-time PCR檢測(cè)雞NOD1信號(hào)通路相關(guān)分子方法的建立及應(yīng)用根據(jù)GenBank上公布的雞NOD樣受體NOD1、信號(hào)傳導(dǎo)分子RIPK2、TRAF6、CARD9、 NF-κB (p65、MAPK11和細(xì)胞因子IL-1β、IL-8的mRNA序列,以β-actin為內(nèi)參基因,設(shè)計(jì)并合成8個(gè)目的基因及1個(gè)內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增引物,建立檢測(cè)雞NOD1、RIPK2、 TRAF6、CARD9、NF-κB (p65)、MAPK11和細(xì)胞因子IL-1β、IL-8 mRNA表達(dá)水平的相對(duì)熒光定量PCR方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示,9個(gè)基因的熒光定量PCR方法溶解曲線均呈單峰,溶解溫度在81.5℃～89.0℃之間,RT-PCR擴(kuò)增效率為96.3%～102.3%,相關(guān)系數(shù)為0.966-0.996,斜率為-3.269～-3.413；Ct值的變異系數(shù)在1.85%～3.84%之間。表明,所建立的檢測(cè)8個(gè)目標(biāo)基因和1個(gè)內(nèi)參基因mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性高,完全滿足實(shí)驗(yàn)要求,為后續(xù)試驗(yàn)研究提供技術(shù)支持。3.雞不同組織中NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11的表達(dá)譜分析NOD1是NLR受體中的一個(gè)重要成員,RIPK2是其接頭分子,RIPK2的活化可以引起下游NF-κB和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活,因此,研究雞的不同組織器官中NOD1及其相應(yīng)接頭蛋白R(shí)IPK2及信號(hào)傳遞分子NF-κB和MAPK11的表達(dá)水平,有助于理解和分析機(jī)體對(duì)病原的先天性免疫應(yīng)答過(guò)程。為確定NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11 mRNA在雞體內(nèi)組織中的表達(dá)情況,本研究對(duì)1日齡雛雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、法氏囊、小腸(十二指腸)、腦、睪丸、卵巢、直腸和血液共13種組織中該四個(gè)基因mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11在檢測(cè)的13種組織中均有表達(dá),但同一基因在不同組織中的表達(dá)量差異較大。其中,NOD1和NF-κB在血液中表達(dá)最高,RIPK2、MAPK11在腦組織中表達(dá)量最高。說(shuō)明,NOD1、RIPK2、NF-κB和MAPK11在雞體的各組織中廣泛表達(dá)。4.雞NOD1基因?qū)ο掠涡盘?hào)分子的調(diào)節(jié)作用研究為了探討雞NOD1基因?qū)ο掠涡盘?hào)通路相關(guān)分子的調(diào)節(jié)作用,本研究通過(guò)RNAi抑制和外源性iE-DAP誘導(dǎo)NOD1的表達(dá)后,檢測(cè)了RIPK2、NF-κB、TRAF6、CARD9、MAPK11、 IL-1β和IL-8等基因的表達(dá)變化,以探討NOD1在HD11細(xì)胞中對(duì)這些基因的調(diào)節(jié)作用。本研究構(gòu)建了三個(gè)表達(dá)質(zhì)粒和一個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒,即PLL3.7-NOD1-shRNA1、 PLL3.7-NOD1-shRNA2、PLL3.7-NOD1-shRNA3和PLL3.7-NOD1-control shRNA。三個(gè)表達(dá)質(zhì)粒在HD11細(xì)胞中的抑制效率結(jié)果表明,與PLL3.7-NOD1-control shRNA相比,PLL3.7-NOD1-shRNA1、PLL3.7-NOD1-shRNA2和PLL3.7-NOD1-shRNA3印制效率在48h時(shí)分別為34.1%、19.3%和81.4%,在72h時(shí)分別為37.9%、58.1%和69.1%。檢測(cè)了轉(zhuǎn)染PLL3.7-NOD1-shRNA3表達(dá)載體和iE-DAP處理的HD11細(xì)胞中的PIPK2、NF-κB(p65)、TRAF6、CARD9、MAPK11、IL-1β和IL-8的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在PLL3.7-NOD1-shRNA3抑制和iE-DAP激活HD11細(xì)胞中NOD1的表達(dá)水平后,除IL-1p外,信號(hào)傳導(dǎo)分子RIPK2、 NF-κB(p65)、TRAF6、CARD9、MAPK11細(xì)胞因子IL-8的表達(dá)水平也出現(xiàn)了相應(yīng)的下調(diào)和上調(diào)。這些結(jié)果提示,雞NOD1基因?qū)ζ湫盘?hào)通路下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子RIPK2、 NF-KB(p65)、TRAF6、CARD9、MAPK11及細(xì)胞因子IL-8的表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)作用。5.雞NOD1信號(hào)通路對(duì)沙門(mén)氏菌的識(shí)別作用已有研究表明沙門(mén)氏菌可以激活NOD1信號(hào)通路,NOD1蛋白通過(guò)與下游的受體作用蛋白-2(RIPK2)分子相互作用,激活NF-κB、MAPK信號(hào)通路。然而,在禽類,沙門(mén)氏菌感染是否可以激活NOD1信號(hào)通路尚不清楚,因此,為了研究雞NOD1信號(hào)通路相關(guān)基因在沙門(mén)氏菌感染過(guò)程中的作用,本研究通過(guò)在體實(shí)驗(yàn),選擇10日齡AA肉雞,經(jīng)皮下每只注射0.2m1濃度為1×108cfu/mL的雞白痢沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌菌液,同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。檢測(cè)沙門(mén)氏菌感染后的1d、3d、5d和7d脾臟和血液中NOD1、RIPK2、NF-κB、MAPK11、IL-1β和IL-8表達(dá)量變化。結(jié)果顯示,雞白痢沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌感染后,NOD1、RIPK2、 NF-κB、MAPK11、IL-1β和IL-8的表達(dá)量在感染后的1-7d呈波動(dòng)變化,表達(dá)量高峰是在感染后的3d、5d或7d。在HD11細(xì)胞中,用雞白痢沙門(mén)氏菌感染細(xì)胞,檢測(cè)NOD1信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá),結(jié)果表明,NOD1基因的表達(dá)量在雞白痢沙門(mén)氏菌感染的3.5h和6h顯著降低,1h、24h顯著增加；RIPK2在雞白痢沙門(mén)氏菌感染后6h,NF-κB在雞白痢沙門(mén)氏菌感染后1h表達(dá)量顯著下降,3.5h、6h和24h顯著增加；MAPK11的表達(dá)量在雞白痢沙門(mén)氏菌感染后的1h、6h略有下降但差異不顯著,24h時(shí)表達(dá)量顯著增加。細(xì)胞因子IL-1p和IL-8的表達(dá)量在雞白痢沙門(mén)氏菌感染后的1h、3.5h、6h和24h的表達(dá)量均顯著增加。用iE-DAP處理HD11細(xì)胞,再進(jìn)行雞白痢沙門(mén)氏菌感染,檢測(cè)雞白痢沙門(mén)氏菌對(duì)細(xì)胞的侵襲率及在細(xì)胞內(nèi)的增殖情況。結(jié)果表明,iE-DAP處理組的雞白痢沙門(mén)氏菌的侵襲率和未處理組的侵襲率沒(méi)有顯著差異,但在4h和6h時(shí),iE-DAP處理組的胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著低于未用iE-DAP處理組的細(xì)菌數(shù)。結(jié)果提示,雞NOD1信號(hào)通路在雞和HD11細(xì)胞對(duì)沙門(mén)氏菌的清除過(guò)程中具有重要作用。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S831
【圖文】：

雞的全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度為４５０２ｂｐ，利用ＮＣＢＩ提供的ＯＲＦｆｍｄｅｒ進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因包含逡逑一個(gè)長(zhǎng)度為邋２８５６ｂｐ邋的開(kāi)放閱讀框（Ｏｐｅｎ邋ｒｅａｄｉｎｇ邋ｆｒａｍｅ）邋，邋１２４ｂｐ邋的邋５’ＵＴＲ，和邋１４９７ｂｐ邋的逡逑３’ＵＴＲ，后接２２ｂｐ的ｐｏｌｙＡ尾己（如圖１．２所示）。經(jīng)過(guò)注釋己提交ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取逡逑序列登錄號(hào)，登錄號(hào)為ＪＸ４６５４８７。逡逑－１２４逡逑ＧＧＣＴＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＴＧＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＡＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧ

１．２．２３用ＴＭＨＭＭ分析跨膜區(qū)逡逑采用ＴＭＨＭＭ軟件進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明雞ＮＯＤＩ蛋白無(wú)跨膜區(qū)；ＳｉｇｎａｌＰ邋４．１逡逑Ｓｅｒｖｅｒ預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白無(wú)信號(hào)r潰ㄍ跡保擔(dān)得鞲玫鞍撞皇悄さ鞍�。辶x希櫻紓睿幔。校矗卞澹穡潁澹洌椋悖簦椋錚鑠澹椋澹酰耄睿澹簦潁錚潁耄螅澹櫻澹瘢酰澹睿悖邋義希裕祝齲停灣澹穡錚螅簦澹潁椋錚蟈澹穡潁錚簦幔猓椋歟椋媯椋澹簀澹媯錚蟈澹族邇汕膳螅攏茫佩巍鰣五五危蓿蓿掊巍鰣五義希ⅰ鰣澹懾澹懾澹懾濉鰣巍鰣危懾澹懾巍鰣危咤澹懾危茫螅閎紓邋邋五義希у濉保埃危櫻螅悖錚潁邋邋危義希五危邋濉В誨危伲螅悖镥邇梢誨義希卞

本文編號(hào)：2744446