【摘要】：目的:應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染技術(shù),探討突變型KCNJ5 G151R、del I157基因?qū)θ四I上腺皮質(zhì)腺癌H295R細胞分泌醛固酮的影響。方法:構(gòu)建野生型KCNJ5、突變型KCNJ5 G151R、突變型KCNJ5 del I157和空載體質(zhì)粒,采用脂質(zhì)體LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染H295R細胞,將其分為野生型KCNJ5組、突變型KCNJ5G151R組、突變型KCNJ5 del I157組和對照組。將質(zhì)粒脂質(zhì)體復合物轉(zhuǎn)染H295R細胞后,更換為含和不含100n M(nmol/L)血管緊張素Ⅱ的培養(yǎng)基,以及含和不含10u M(umol/L)維拉帕米的培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時。采用Di SBAC2熒光染料檢測各組細胞膜電位變化;使用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)方法檢測各組細胞KCNJ5蛋白表達水平;應(yīng)用放射免疫技術(shù)檢測各組細胞上清液中醛固酮濃度;實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)技術(shù)檢測細胞中11-β羥化酶(CYP11B1)、醛固酮合酶(CYP11B2)基因的表達水平。結(jié)果:(1)與對照組相比,兩組轉(zhuǎn)染KCNJ5 G151R、KCNJ5 del I157的H295R細胞質(zhì)內(nèi)熒光增強,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)KCNJ5蛋白在轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒、野生型KCNJ5、突變型KCNJ5 G151R、突變型KCNJ5 del I157的H295R細胞中平均表達量為1.08±0.04、1.64±0.07、1.82±0.04、1.87±0.05。采用t檢驗將各實驗組分別與對照組相比,野生型KCNJ5組、突變型KCNJ5 G151R組、突變型KCNJ5 del I157組KCNJ5蛋白表達均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。突變型KCNJ5 G151R組與KCNJ5 del I157組比較,差異不顯著(P0.05)。(3)使用放射免疫分析法檢測上清液中醛固酮濃度,突變型KCNJ5 G151R組是對照組的2.86倍(1.720±0.045vs0.600±0.039ng/ml,P0.05),突變型KCNJ5 del I157組是對照組的2.26倍(1.356±0.036vs0.600±0.039ng/ml,P0.05),而野生型KCNJ5組與對照組差異不顯著(0.636±0.053vs0.600±0.039ng/ml,P0.05)。(4)CYP11B1 mRNA在對照組、野生型KCNJ5組、突變型KCNJ5 G151R組、突變型KCNJ5 del I157組細胞中表達量為1±0.439、1.244±0.774、4.404±0.820、3.089±0.691。采用t檢驗將各組與對照組相比,突變型KCNJ5 G151R組、突變型KCNJ5del I157組H295R細胞中CYP11B1 mRNA表達明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。野生型KCNJ5組與對照組比較,差異不顯著(P0.05)。(5)CYP11B2 mRNA在對照組、野生型KCNJ5組、突變型KCNJ5 G151R組、突變型KCNJ5 del I157組H295R細胞中表達量為1±0.106、1.302±0.275、2.644±0.063、1.736±0.269。采用t檢驗將各組與對照組相比,突變型KCNJ5 G151R組、突變型KCNJ5del I157組H295R細胞CYP11B2 mRNA表達明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。野生型KCNJ5組與對照組比較,差異不顯著(P0.05)。(6)血管緊張素Ⅱ刺激后,轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 G151R的H295R細胞分泌醛固酮升高1.39倍(2.381±0.051vs1.704±0.045ng/ml,P0.05),轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 del1I57對的H295R細胞分泌醛固酮升高1.67倍(2.263±0.042vs1.349±0.046ng/ml,P0.05)。轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 G151R的H295R細胞中CYP11B1 mRNA表達量增加(1.000±0.036 vs 1.466±0.161,P0.05),轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 G151R的H295R細胞中CYP11B2 mRNA表達量增加(1.000±0.066 vs 1.806±0.166,P0.05),轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 del I157的H295R細胞中CYP11B1 mRNA表達量增加(0.796±0.104 vs 1.576±0.064,P0.05),轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 del I157的H295R細胞中CYP11B2 mRNA表達量增加(0.867±0.073 vs 2.116±0.052,P0.05)。(7)維拉帕米干預后,使轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 G151R的H295R細胞分泌醛固酮水平下降37.9%(1.720±0.045vs1.068±0.034ng/ml,P0.05),轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 del I157的H295R細胞分泌醛固酮水平下降26.8%(1.356±0.036ng/mlvs0.992±0.046,P0.05)。轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 G151R的H295R細胞中CYP11B1 mRNA表達量降低(4.044±1.020 vs 2.455±0.574,P0.05),轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 G151R的H295R細胞中CYP11B2 mRNA表達量降低(2.664±0.527 vs 1.266±0.401,P0.05)。轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 del I157的H295R細胞中CYP11B1mRNA表達量降低(8.053±1.038 vs 3.089±0.691,P0.05),轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 del I157的H295R細胞中CYP11B2 mRNA表達量降低(2.623±0.313 vs 1.736±0.469,P0.05)。結(jié)論:(1)突變型KCNJ5G151R和KCNJ5 del I157可能通過使H295R細胞膜電位發(fā)生去極化,使醛固酮合酶基因CYP11B2表達水平增加,導致H295R細胞分泌的醛固酮增多。(2)血管緊張素Ⅱ刺激后,轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 G151R和KCNJ5del I157的H295R細胞中CYP11B2 mRNA的表達及醛固酮分泌量增加。(3)維拉帕米干預后,轉(zhuǎn)染突變型KCNJ5 G151R和KCNJ5 del I157的H295R細胞中CYP11B2 mRNA的表達及醛固酮分泌量下降。
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R736.6
【圖文】：

西 南 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文結(jié) 果、人腎上腺皮質(zhì)腺癌 NCI-H295R 細胞培養(yǎng)購買的人腎上腺皮質(zhì)腺癌 NCI-H295R 細胞，使用含 2%Ultroser 培養(yǎng)基能培養(yǎng)成功，在倒置顯微鏡下見 NCI-H295R 細胞貼壁生長，態(tài)良好，輪廓清晰，呈多角形,兩極有軸突樣長凸起，細胞間成網(wǎng)結(jié)構(gòu)（如圖 1）。

圖 2：按 Lipofectamine 3000 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染手冊分組轉(zhuǎn)染 36h 后，熒光顯微鏡下各組細胞熒光表達情況。3、KCNJ5 基因?qū)?H295R 細胞 KCNJ5 蛋白表達影響將空載體質(zhì)粒（A 組）、野生型 KCNJ5（B 組）、突變型 KCNJ5G151R（C 組）和突變型 KCNJ5 del157I（D 組）轉(zhuǎn)入 H295R 細胞，于 37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 36 小時后，使用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot ）檢測各組細胞中 KCNJ5 蛋白表達情況（如圖 3、4），KCNJ5 蛋白分別在各組中的平均表達量為 A 組：1.08±0.04，B 組：1.64±0.07，C 組：1.82±0.04，D 組：1.87±0.05。與對照組相比，兩個獨立樣本間比較，轉(zhuǎn)染野生型 KCNJ5 組、突變型 KCNJ5 G151R組、突變型 KCNJ5 delI157 組 KCNJ5 蛋白表達明顯高于對照組，差

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本文編號：2741344