【摘要】：研究目的:血友病甲(HA)的基因治療,可以克服傳統(tǒng)替代療法的弊端,并且通過構(gòu)建有較高表達(dá)效率的FⅧ表達(dá)元件,從而降低轉(zhuǎn)運(yùn)載體(AAV)的劑量,降低免疫反應(yīng),可在一定程度上減少抑制物的形成。關(guān)于提高FⅧ的表達(dá)效率,除密碼子優(yōu)化策略以外,也有研究表明,不同物種來源的FⅧ,其生物學(xué)活性可比人FⅧ(hFⅧ)活性高,然而關(guān)于比較大鼠FⅧ(rFⅧ)與hFⅧ活性的研究未見相關(guān)報(bào)道,并且基于rFⅧ與hFⅧ在核苷酸及氨基酸水平均有較高的同源性(分別為61%、51%),我們研究的目的是想通過比較rFⅧ與hFⅧ活性差異,通過差異氨基酸替換的方法,對(duì)hFⅧ序列進(jìn)行點(diǎn)突變,進(jìn)而期望為AAV介導(dǎo)的HA的基因治療及構(gòu)建有較高表達(dá)效率的FⅧ表達(dá)元件提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。研究方法:我們將hFⅧ-BDD-SQ、rFⅧ-BDD SQ、hHC、hLC、rHC、rLC分別克隆到帶有CB promoter(泛表達(dá))和ApoE-hAAT promoter(肝臟特異表達(dá))的質(zhì)粒表達(dá)載體中,采取單鏈策略及HC、LC分開的雙鏈策略,轉(zhuǎn)染293T和HepG2細(xì)胞,收轉(zhuǎn)染后指定時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)上清,檢測FⅧ的活性(APTT法)及轉(zhuǎn)染上清中FⅧ的抗原表達(dá)量(ELISA及Western blot法)。質(zhì)粒高壓注射HA小鼠,取高壓注射后指定時(shí)間點(diǎn)小鼠外周血血漿樣本,進(jìn)行FⅧ的活性和抗原表達(dá)量檢測。將ApoE-hAAT promoter攜帶的hHC、hLC、rHC、rLC分別包裝、純化AAV病毒,按HC:LC=1:1的比例,分為高劑量組(2×10~(13)vg/kg)和中劑量組(8×10~(12)vg/kg),尾靜脈注射HA小鼠,每兩周采集外周血監(jiān)測FⅧ在HA小鼠體內(nèi)的長期表達(dá)效果,并評(píng)價(jià)AAV載體介導(dǎo)的HA基因治療的安全性。研究結(jié)果:我們通過體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),rFⅧ活性高于hFⅧ活性。并且,體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,rLC聯(lián)合hHC能夠提高FⅧ的活性,而對(duì)FⅧ抗原表達(dá)量的影響不大,提高FⅧ比活性約4-5倍;rLC聯(lián)合hHC提高FⅧ的活性,可排除通過提高轉(zhuǎn)染上清中FⅧ的熱穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn),考慮主要受rLC分子本身性質(zhì)的影響。在體內(nèi),HA小鼠高壓注射結(jié)果顯示,rLC能夠提高FⅧ的活性和比活性,其比活性提高約4.5倍;AAV病毒攜帶的hHC、hLC、rLC注入HA小鼠體內(nèi),無論是中劑量組還是高劑量組,rLC均能夠提高FⅧ的活性,尤其在高劑量組,hHC+rLC與hHC+hLC活性總體具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,AAV介導(dǎo)的FⅧ均能夠在HA小鼠體內(nèi)長期表達(dá)至36周,且小鼠肝臟功能基本保持正常,在高劑量組有一只小鼠有抑制物產(chǎn)生。研究結(jié)論:體內(nèi)外研究結(jié)果提示,rFⅧ活性高于hFⅧ;rLC聯(lián)合hHC能夠提高FⅧ的活性、比活性;AAV介導(dǎo)的FⅧ基因治療HA小鼠,可使小鼠體內(nèi)FⅧ長期維持在治療水平,且總體上,hHC+rLC活性高于hHC+hLC活性;并且rLC與hLC氨基酸序列差異,在提高FⅧ活性、比活性中起主要作用。該研究為AAV介導(dǎo)的HA的基因治療及構(gòu)建有著較高表達(dá)效率的FⅧ表達(dá)元件提供了基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù),也為構(gòu)建能提高h(yuǎn)FⅧ活性的新型FⅧ序列提供了新的選擇。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R554.1
【圖文】：

上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文Ⅸ,FⅨ)基因被克隆成功，血友病的基因治療就被作為一個(gè)長期的目標(biāo)，也一直是國際血友病治療研究的熱點(diǎn)[14]。直到 2011 年 Nathwani 等[15]發(fā)表了在英國開展的一項(xiàng)HB 基因治療的臨床研究，該項(xiàng)研究獲得了理想的療效，這項(xiàng)有里程碑意義的研究極大地鼓舞了國際血友病基因治療研究學(xué)者探索 HA 基因治療的熱情。基因治療不僅可以克服傳統(tǒng)替代療法的弊端，而且可以維持合適的載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因 FⅧ在體內(nèi)持久、高效的表達(dá)，為 HA 患者的治愈帶來希望。

上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文AAV 載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)許多組織，實(shí)現(xiàn)基因的穩(wěn)定表達(dá)并且具有較低的免疫原性[26]。臨床實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，AAV 是理想的能夠?qū)崿F(xiàn)基因遞送到分裂后細(xì)胞和組織的載體[26]。AAV 載體是血友病基因治療中備受關(guān)注的載體[27]。與 HB 缺乏的 FⅨ不同，F(xiàn)Ⅷ cDNA 片段較大，F(xiàn)Ⅷ cDNA 約 7.0kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了 AAV 載體的包裝容量（4.7kb）限制，難以實(shí)現(xiàn)高效的包裝和表達(dá)，限制了 HA基因治療的發(fā)展[28]。成熟的 FⅧ蛋白由 6 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包括 3 個(gè)同源的 A 區(qū)，2個(gè)同源的 C 區(qū)和 1 個(gè) B 區(qū)按照 A1（a1）-A2（a2）-B（a3）-A3-C1-C2 順序構(gòu)成含2332 個(gè)氨基酸的高分子量蛋白,去除 B 結(jié)構(gòu)域的 FⅧ（FⅧ-BDD）對(duì) FⅧ的活性沒有影響[29]。FⅧ蛋白在水解活化過程中，可產(chǎn)生包括由 A1-A2-B 結(jié)構(gòu)域組成的重鏈（Heavy chain, HC）以及 A3-C1-C2 結(jié)構(gòu)域組成的輕鏈（Light chin,LC）構(gòu)成的異二聚體（Heterodimer）[30]，并進(jìn)一步水解活化成有活性的片段，發(fā)揮止血功能。

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本文編號(hào)：2740718