【摘要】：本研究通過(guò)對(duì)木本基質(zhì)下培養(yǎng)的糙皮側(cè)耳7株不同菌株進(jìn)行降解木質(zhì)素的高效菌株進(jìn)行篩選,對(duì)篩選出來(lái)的糙皮側(cè)耳菌株采用Illumina HiSeq 4000 SBS高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,挖掘糙皮側(cè)耳降解木質(zhì)基質(zhì)的候選基因,通過(guò)比對(duì)到NR、Swissprot、KEGG、String、Pfam等數(shù)據(jù)庫(kù)中得到差異基因相關(guān)信息,再通過(guò)GO富集分析、pathway富集分析,得到與降解木質(zhì)素、纖維素相關(guān)的候選基因以及相關(guān)的主要代謝通路。再對(duì)與木質(zhì)素降解相關(guān)的候選基因中挑選出3個(gè)過(guò)氧化物酶基因c30793-g1、c28624_g1、c31898_g1,利用基因工程手段對(duì)3個(gè)過(guò)氧化物酶基因進(jìn)行克隆以及異源表達(dá)載體的構(gòu)建,主要研究結(jié)果如下:1、對(duì)糙皮側(cè)耳四季大白、平菇1號(hào)、平菇2號(hào)、pL109、pL206、pL305、pL539這7株菌株進(jìn)行了定性篩選和定量篩選,通過(guò)變色圈實(shí)驗(yàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株的定性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明7株菌株均有降解木質(zhì)素的能力,根據(jù)菌落直徑與變色圈直徑比值d1/d2以及生長(zhǎng)狀況篩選出四季大白與PL305降解木質(zhì)素的能力較強(qiáng)。定量篩選通過(guò)計(jì)算木質(zhì)素降解率和綜纖維素降解率以及SF值,SF值0.91為平菇1號(hào)和PL206,SF值0.83為四季大白。木質(zhì)素降解率最高的為四季大白14.87%,,綜纖維素降解率最低為PL109為7.80%。綜上篩選出四季大白是本次實(shí)驗(yàn)的高效菌株。2、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共得到有效數(shù)據(jù)共78.47Gb,糙皮側(cè)耳轉(zhuǎn)錄本序列64228條,單基因序列共46417條。使用BLast工具將轉(zhuǎn)錄本序列比對(duì)到NR、Swissprot、KEGG、String、Pfam等數(shù)據(jù)庫(kù)中,共有33736條序列得到注釋。得到1408條差異表達(dá)基因,其中有1183條基因?yàn)樯险{(diào),通過(guò)GO富集分析得到,差異基因顯著富集于木質(zhì)素分解代謝過(guò)程、錳過(guò)氧化物酶活性、苯丙素分解代謝過(guò)程中。將差異基因比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中,共有313條得到注釋的序列并對(duì)其進(jìn)行pathway富集分析,得到差異基因顯著富集于氨基苯甲酸降解過(guò)程、色氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、等通路中。其中c27028_g1、c28624_g1、c30793_g1、c30849_g1等基因與木質(zhì)素降解過(guò)程相關(guān)性較高。c24893_g1、c29559_g1、c29956_g2等基因與纖維素降解的過(guò)程相關(guān)性較高。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果篩選出來(lái)的與木質(zhì)素降解相關(guān)的候選關(guān)鍵基因中,挑選出c31898_g1、c28624_g1、c30793-g1三個(gè)過(guò)氧化物酶基因,利用RT-PCR技術(shù)對(duì)這3個(gè)基因進(jìn)行了克隆,成功克隆3個(gè)基因后,進(jìn)行PMD-19T載體的連接,得到了c30793-PlxMD19-T、c28624-PMD19-T、c31898-PMD19-T 三個(gè)重組載體,c30793-PMD19-T、c28624-PMD19-T、c31898-PMD19-T三個(gè)重組載體與目的載體pGAPZαA進(jìn)行雙酶切,酶切后進(jìn)行連接,成功構(gòu)建3個(gè)重組表達(dá)載體c28624-pGAPZαA、c31898-pGAPZαA、c30793-pGAPZαA。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S646.14
【圖文】：

圖２－１邋７株菌株的變色圈逡逑表２－２變色圈直徑、菌落直徑菌落直徑（ｄｌ）邋ｃｍ邐變色圈直徑（ｄ２）邋ｃｍ邋ｄｌ／ｄ２逡逑５＾８邐＇邐４＾８邐Ｖ２＼逡逑６．６邐５．１邐１．２９逡逑５．３邐２．２邐２．４１逡逑５．５邐３．１邐１．７７逡逑７．４邐６．１邐１．２１逡逑６．８邐５．３邐１．２８逡逑＾６邐４＾邐Ｌ２１選的結(jié)果與分析逡逑解木質(zhì)素和綜纖維素的降解率進(jìn)行了計(jì)算，從表中可看出木為四季大白，其次為ＰＬ３０５，降解率分別為１２．３７％、１０．３０降解率也為最高，分別為１４．８７％、１３．４０％。木質(zhì)素降解率解率為７．８０％，對(duì)綜纖維素降解率較低的菌株有ＰＬ２０６和平１０．８０％逡逑表２－３木粉纖維素降解數(shù)據(jù)辦二畝■培養(yǎng)前綜纖培養(yǎng)前綜纖培養(yǎng)后綜纖逡逑

圖３－１邋ＲＮＡ電泳圖逡逑組測(cè)序數(shù)據(jù)與組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)逡逑種不同培養(yǎng)基質(zhì)樣品，木本培養(yǎng)基（ＰＯ＿Ｗ）、ＰＤ培養(yǎng)基（ＰＯ＿Ｃ進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析表明（表３－４），有效數(shù)據(jù)共７８．４７Ｑ２０堿基百分比均不小于９８．７０％，邋Ｑ３０堿基百分比均不小于９５．９效，能夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。逡逑結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表３－５），得到６４２２８條序列重疊群組裝轉(zhuǎn)錄本序，Ｎ５０長(zhǎng)３７３４邋ｂｐ。得到４６４１７條轉(zhuǎn)錄本序列組裝單基因序列，序１ｂｐ，邋Ｎ５０長(zhǎng)２８５９邋ｂｐ，單基因序列的平均長(zhǎng)度主要為１？１０００邋ｂｐ度大于邋１０００邋ｂｐ邋的有邋８１９４邋條，占邋１７．６５％。逡逑數(shù)據(jù)提交到ＮＣＢＩ中，ＳＲＡ登陸號(hào)：ＳＲＰ１０７８２４。逡逑表３－４樣品有效數(shù)據(jù)評(píng)估讀數(shù)邐堿基邐錯(cuò)誤率／％邐Ｑ２０／％邐Ｑ３０／％５８６４００８６邐８７６０７６８７２８邐ＯＭＵ邐９８．７８邐９６Ｔ７５４０７３５４２邐８０７３５１０７１７邐０．０１１３邐９８．７３邐９６．０６

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2741479