【摘要】：目的研究皮膚橋蛋白(DPT)和底板反應(yīng)蛋白(SPON1)基因過表達(dá)后對肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響,探討DPT、SPON1基因在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用,為肝癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的生物學(xué)指標(biāo)及基因治療提供新的靶點。方法1、肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1、HepG2及正常人肝細(xì)胞株L-02中DPT、SPON1基因及蛋白表達(dá)的檢測:三種細(xì)胞培養(yǎng),并抽提其總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用qPCR檢測DPT、SPON1基因的本底表達(dá)。提取三種細(xì)胞樣本中的總蛋白,采用western blot檢測其中DPT、SPON1蛋白的本底表達(dá)。2、含DPT、SPON1基因慢病毒質(zhì)粒載體的包裝及肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染:將DPT、SPON基因慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-DPT-IRES-EGFP、pLenti6.3-SPON1-IRES-EGFP分別與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進行目的基因過表達(dá)的慢病毒包裝。確定包裝成功后分別用含DPT、SPON1過表達(dá)慢病毒的293T細(xì)胞的培養(yǎng)液及慢病毒陰性對照病毒液Lenti-EGFP感染靶細(xì)胞SK-Hep-1、HepG2。實驗設(shè)空白對照組、空質(zhì)粒陰性對照組(NC組)和目的基因過表達(dá)組,qPCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞DPT、SPON1基因的表達(dá),WB檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞DPT、SPON1蛋白的表達(dá)。3、轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的增殖及遷移侵襲能力檢測:CCK-8實驗檢測細(xì)胞的增殖情況,轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞在不同時間點(1D、2D、3D、4D、5D)用酶標(biāo)儀讀取450nm處的吸光值(OD值),根據(jù)OD值結(jié)果計算細(xì)胞的生長活力變化。Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力,實驗中細(xì)胞轉(zhuǎn)入Transwell小室24小時后固定染色,用酶標(biāo)儀讀取OD值,比較細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞轉(zhuǎn)入鋪備基質(zhì)膠的Transwell小室48小時后固定染色,用酶標(biāo)儀讀取OD值,比較細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果1、qPCR檢測DPT、SPON1基因在肝癌細(xì)胞SK-Hep-1、HepG2及正常人肝細(xì)胞株L-02的表達(dá):結(jié)果顯示,DPT基因及蛋白在肝癌細(xì)胞SK-Hep-1、HepG2中表達(dá)均低于正常人肝細(xì)胞株L-02,在SK-Hep-1中最低,故選表達(dá)最低的肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1作為研究DPT基因過表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖遷移能力的后續(xù)實驗。SPON1基因及蛋白在肝癌細(xì)胞SK-Hep-1、HepG2中表達(dá)均低于正常人肝細(xì)胞株L-02,在HepG2中最低,故選取HepG2細(xì)胞作為SPON1基因過表達(dá)后續(xù)實驗。2、慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察:攜帶熒光標(biāo)記的DPT、SPON1過表達(dá)慢病毒分別轉(zhuǎn)染SK-Hep-1、HepG2細(xì)胞后48h,熒光顯微鏡下觀察,可見綠色熒光信號明顯,細(xì)胞生長狀態(tài)良好,說明轉(zhuǎn)染成功。3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá):采用qPCR分別檢測SK-Hep-1細(xì)胞DPT基因及HepG2細(xì)胞中SPON1基因的表達(dá)。結(jié)果表明:在SK-Hep-1細(xì)胞實驗中,與空白組和NC組相比,實驗組(過表達(dá)組,SK-Hep-1-DPT)細(xì)胞中的DPT基因表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01);在HepG2細(xì)胞實驗中,與空白組和NC組相比,實驗組(過表達(dá)組,HepG2-SPON1)細(xì)胞中SPON1基因表達(dá)同樣顯著上調(diào)(P0.01);說明兩種過表達(dá)慢病毒包裝成功。4、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DPT、SPON1蛋白表達(dá):慢病毒介導(dǎo)的目的基因轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后提取總蛋白,WB檢測發(fā)現(xiàn),DPT蛋白在過表達(dá)組(SK-Hep-1-DPT)細(xì)胞中表達(dá)顯著高于空白組和NC組(P0.05);SPON1蛋白在過表達(dá)組(HepG2-SPON1)細(xì)胞中表達(dá)同樣高于空白組和NC組(P0.01)。進一步證明兩種過表達(dá)慢病毒包裝成功。5、CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的增殖:CCK-8法分別檢測三組細(xì)胞在不同時間點的增殖情況,結(jié)果顯示,與空白組和NC組相比,過表達(dá)DPT組(SK-Hep-1-DPT)細(xì)胞的增殖活力顯著受到抑制(P0.05)。過表達(dá)SPON1組(HepG2-SPON1)細(xì)胞的增殖活力同樣受到抑制(P0.05)。說明過表達(dá)DPT和SPON1顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖。6、Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲:結(jié)果顯示,與空白組和NC組對比,過表達(dá)DPT組(SK-Hep-1-DPT)細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到顯著抑制(P0.05)。過表達(dá)SPON1組(HepG2-SPON1)細(xì)胞的遷移和侵襲能力也明顯受到抑制(P0.01)。說明過表達(dá)DPT和SPON1顯著抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。結(jié)論1、DPT基因及蛋白在SK-Hep-1細(xì)胞中本底表達(dá)最低,選取SK-Hep-1細(xì)胞作為DPT過表達(dá)及影響肝癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力的后續(xù)實驗;SPON1基因及蛋白在HepG2細(xì)胞中本底表達(dá)最低,選取HepG2細(xì)胞作為SPON1過表達(dá)及影響肝癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力的后續(xù)實驗。2、兩種目的基因過表達(dá)慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染兩種肝癌細(xì)胞株后,DPT、SPON1基因及蛋白表達(dá)顯著上調(diào),說明過表達(dá)慢病毒包裝成功。3、CCK-8實驗結(jié)果顯示過表達(dá)DPT基因顯著抑制SK-Hep-1細(xì)胞的增殖,過表達(dá)SPON1基因顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖。說明過表達(dá)DPT和SPON1顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖。4、Transwell實驗結(jié)果顯示過表達(dá)DPT基因顯著抑制SK-Hep-1細(xì)胞遷移侵襲能力,過表達(dá)SPON1基因顯著抑制HepG2細(xì)胞遷移侵襲能力。說明過表達(dá)DPT和SPON1顯著抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7
【圖文】：

結(jié) 果檢測 SK-Hep-1、HepG2、L-O2 細(xì)胞中 DPT、SPON檢測 DPT 基因在肝癌細(xì)胞 SK-Hep-1、HepG2 中表達(dá)2，在 SK-Hep-1 中最低（圖 1-3）；進一步檢測 DPT達(dá)，結(jié)果顯示，DPT 蛋白在 SK-Hep-1、HepG2 肝癌常人肝細(xì)胞株 L-02，在 SK-Hep-1 中最低（圖 1-6）的肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1作為研究DPT基因過表達(dá)對續(xù)實驗。SPON1 基因在正常人肝細(xì)胞株 L-02 中表達(dá)（圖 1-4）。進一步檢測 SPON1 蛋白在三種細(xì)胞中的N1 蛋白同樣在正常人肝細(xì)胞株 L-02 中表達(dá)最高，在故選取 HepG2 細(xì)胞作為 SPON1 基因過表達(dá)后續(xù)實驗

移能力的后續(xù)實驗。SPON1 基因在正常人肝細(xì)胞株 L-02 中表達(dá)最高，在 HepG2細(xì)胞中最低（圖 1-4）。進一步檢測 SPON1 蛋白在三種細(xì)胞中的本底表達(dá)，結(jié)果顯示，SPON1 蛋白同樣在正常人肝細(xì)胞株 L-02 中表達(dá)最高，在 HepG2 中最低（圖 1-7）。故選取 HepG2 細(xì)胞作為 SPON1 基因過表達(dá)后續(xù)實驗。圖 1-1. SK-Hep-1、Hepg2、L-O2 細(xì)胞的 RNA 抽提電泳圖

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本文編號：2740567