【摘要】：目的:乳腺癌是女性發(fā)病率高居首位的惡性腫瘤,全球每年約170萬(wàn)人罹患該腫瘤。根據(jù)2012年數(shù)據(jù),全球每年大約有50萬(wàn)人死于乳腺癌。盡管乳腺癌的診斷和治療已經(jīng)取得了很大進(jìn)展,但由于腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍可導(dǎo)致大量患者預(yù)后不良。因此,從分子水平深入認(rèn)識(shí)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制,明確與之相關(guān)的調(diào)控基因,對(duì)進(jìn)一步改善乳腺癌的治療將具有重要意義。同種異體移植炎癥因子1樣(AIF1L,Allograft inflammatory factor-1 like)蛋白是一類具有EF手型模序結(jié)構(gòu)的鈣結(jié)合蛋白。AIF1L基因定位于9q34.13,由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成,基因全長(zhǎng)3455bp,其中開放閱讀框架453bp,共編碼150氨基酸,其中含有一個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)潛在的乙�；稽c(diǎn),分子量約為17.0kDa,等電點(diǎn)6.63。AIF1L基因在腎臟中表達(dá)最高,正常乳腺組織中中度表達(dá),低表達(dá)于腦、脾臟、肺、骨骼肌和睪丸,而在肝臟中未檢測(cè)到其表達(dá)。既往研究發(fā)現(xiàn)AIF1L蛋白能夠結(jié)合和交聯(lián)F-actin,并和F-actin共定位,而且AIF1L也定位于細(xì)胞突起和粘附結(jié)構(gòu)區(qū)。在志賀氏菌侵襲模型上,可見大量細(xì)胞骨架的重排,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)AIF1L被募集到細(xì)胞片狀偽足。也有研究發(fā)現(xiàn)AIF1L是足細(xì)胞特異表達(dá)基因,使用siRNA沉默AIF1L,會(huì)導(dǎo)致F-actin壓力纖維明顯的缺失和重排,同時(shí)伴隨CD2AP和SYNPO的表達(dá)下調(diào),兩者對(duì)維持足細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性尤為重要。這些研究表明AIF1L參與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的調(diào)控,但其在腫瘤中的作用尚不清楚。到目前為止,尚未發(fā)現(xiàn)AIF1L在乳腺癌中表達(dá)的表型特征,其對(duì)乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的影響以及相關(guān)分子機(jī)制尚不清楚,本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析了AIF1L表達(dá)特征,并分析預(yù)測(cè)了其生物學(xué)功能,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察了AIF1L在乳腺癌組織中的表達(dá)特征,分析了AIF1L與乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的關(guān)系,并探討了相關(guān)分子機(jī)制。研究方法:1、采用生物信息學(xué)方法評(píng)估AIF1L在TCGA、HPA、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌組織的表達(dá),通過DAVID和GSEA分析CCLE數(shù)據(jù)庫(kù),推測(cè)AIF1L基因的生物學(xué)功能及其相關(guān)信號(hào)通路。2、采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)287例乳腺癌組織及44例癌旁非癌組織中AIF1L的表達(dá),并分析其與乳腺癌臨床病理相關(guān)因素和患者預(yù)后的關(guān)系。3、使用攜帶AIF1L基因(或?qū)φ?的腺病毒載體轉(zhuǎn)染MDAMB231細(xì)胞,通過MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn),評(píng)估AIF1L基因?qū)DAMB231細(xì)胞增殖能力和干性的影響;通過劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn),評(píng)估AIF1L基因?qū)DAMB231細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;通過細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn),評(píng)估AIF1L基因?qū)DAMB231細(xì)胞形態(tài)的影響。采用Western blot方法評(píng)價(jià)AIF1L基因?qū)AK-RhoA信號(hào)通路及EMT相關(guān)信號(hào)通路的影響。4、實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件或R語(yǔ)言軟件等分析,實(shí)驗(yàn)圖片處理采用ImageJ軟件,采用Graphpad軟件繪制圖表。計(jì)數(shù)資料采用行×列表的χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn),生存分析采用Kaplan-Meier及l(fā)og-Rank檢驗(yàn),多因素生存分析采用Cox回歸分析。檢驗(yàn)水平α=0.05。結(jié)果:1、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)乳腺癌中AIF1L mRNA的表達(dá)明顯低于正常組織,而乳腺癌中甲基化水平高于正常組織。2、HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中AIF1L主要表達(dá)于腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜,且正常組織較乳腺癌組織表達(dá)高。3、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中AIF1L在腫瘤中表達(dá)均低于正常對(duì)照組。4、DAVID分析和GSEA分析提示AIF1L基因與緊密連接、細(xì)胞骨架、細(xì)胞粘附等信號(hào)通路相關(guān)。5、AIF1L的陽(yáng)性免疫反應(yīng)主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。乳腺癌中AIF1L的表達(dá)率(28.6%,82/287)顯著低于癌旁非癌組織中的陽(yáng)性率(58.3%,28/48)(p=0.007)。AIF1L在三陰性乳腺癌中表達(dá)較低。AIF1L低表達(dá)組與高表達(dá)組相比預(yù)后差,AIF1L高表達(dá)是乳腺癌預(yù)后的保護(hù)因素。6、AIF1L基因可抑制MDAMB231細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、細(xì)胞遷移及侵襲能力以及細(xì)胞伸展水平,該作用可能是通過抑制FAK-RhoA信號(hào)通路蛋白表達(dá)及活化,逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT表型而實(shí)現(xiàn)。結(jié)論:1、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人乳腺癌組織中AIF1L的表達(dá)明顯低于正常組織,且在三陰性乳腺癌中表達(dá)最低;AIF1L參與多種信號(hào)通路,如緊密連接、細(xì)胞粘附、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等,其可能在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。2、免疫組化研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中AIF1L蛋白表達(dá)顯著低于癌旁非癌組織;AIF1L在三陰性乳腺癌組織顯著降低。AIF1L高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后明顯好于AIF1L低表達(dá)患者,AIF1L高表達(dá)是乳腺癌患者的保護(hù)性預(yù)后因素。3、AIF1L可能通過抑制FAK-RhoA信號(hào)通路,抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)通路,進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲,發(fā)揮抑癌基因的作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9
【圖文】：

圖 1.1 腫瘤細(xì)胞系的百科全書（CCLE）中細(xì)胞來(lái)源分類59 種細(xì)胞系詳細(xì)信息見表 1.1。腫瘤細(xì)胞系來(lái)自于德國(guó)微生物菌種保藏中心(DSMZ，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen )，美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC，American type culture collection)和日本生物資源收集中心(JCRB，Japanese Collection of Research Bioresources)細(xì)胞庫(kù)，永生化的乳腺上皮細(xì)胞 HMEL來(lái)自于 Achilles 實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞系相關(guān)信息來(lái)自于各個(gè)網(wǎng)站或者查詢文獻(xiàn)獲得[17-20]。表 1.1 CCLE 數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺細(xì)胞系及其特征CCLE 名字 細(xì)胞系 分子分型 組織學(xué)類型 來(lái)源AU565_BREAST AU565 HER2amp ATCCBT20_BREAST BT-20 TNBC ductal_carcinoma ATCCBT474_BREAST BT-474 HER2amp ductal_carcinoma ATCCBT483_BREAST BT-483 Luminal ductal_carcinoma ATCCBT549_BREAST BT-549 TNBC ductal_carcinoma ATCCCAL120_BREAST CAL-120 Luminal B DSMZCAL148_BREAST CAL-148 Luminal A ductal_carcinoma DSMZCAL51_BREAST CAL-51 DSMZ

3 結(jié)果3.1 HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)中 AIF1L 蛋白的表達(dá)通過檢索 HPA 數(shù)據(jù)庫(kù) AIF1L 在多種組織中的表達(dá)，免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)AIF1L 在腎臟中腎小球和腎小管均高表達(dá)，在子宮內(nèi)膜腺管、乳腺導(dǎo)管上皮、貯精囊腺上皮和附睪腺上皮、大腦皮層的內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚的生黑色素細(xì)胞和表皮細(xì)胞、尾狀核的神經(jīng)細(xì)胞、甲狀腺上皮細(xì)胞、甲狀旁腺上皮細(xì)胞、結(jié)腸腺上皮細(xì)胞、唾液腺上皮細(xì)胞等中-低表達(dá)，其他組織多為陰性，偶可見極低表達(dá)，見圖 1.2。另外在脾臟紅髓和白髓的免疫細(xì)胞中未見 AIF1L 的表達(dá)，但于內(nèi)皮細(xì)胞中呈強(qiáng)表達(dá)。而AIF1 主要表達(dá)于骨髓及免疫系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞，如闌尾、骨髓中造血細(xì)胞、淋巴結(jié)、扁桃體和脾臟紅髓，見圖 1.3。肺臟巨噬細(xì)胞中 AIF1 也存在高表達(dá)。AIF1 和 AIF1L在脾臟中的表達(dá)見圖 1.4。

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本文編號(hào)：2740564