【摘要】：目的:乳腺癌是女性發(fā)病率高居首位的惡性腫瘤,全球每年約170萬人罹患該腫瘤。根據(jù)2012年數(shù)據(jù),全球每年大約有50萬人死于乳腺癌。盡管乳腺癌的診斷和治療已經(jīng)取得了很大進展,但由于腫瘤復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移仍可導致大量患者預后不良。因此,從分子水平深入認識乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機制,明確與之相關(guān)的調(diào)控基因,對進一步改善乳腺癌的治療將具有重要意義。同種異體移植炎癥因子1樣(AIF1L,Allograft inflammatory factor-1 like)蛋白是一類具有EF手型模序結(jié)構(gòu)的鈣結(jié)合蛋白。AIF1L基因定位于9q34.13,由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成,基因全長3455bp,其中開放閱讀框架453bp,共編碼150氨基酸,其中含有一個潛在的磷酸化位點和一個潛在的乙�；稽c,分子量約為17.0kDa,等電點6.63。AIF1L基因在腎臟中表達最高,正常乳腺組織中中度表達,低表達于腦、脾臟、肺、骨骼肌和睪丸,而在肝臟中未檢測到其表達。既往研究發(fā)現(xiàn)AIF1L蛋白能夠結(jié)合和交聯(lián)F-actin,并和F-actin共定位,而且AIF1L也定位于細胞突起和粘附結(jié)構(gòu)區(qū)。在志賀氏菌侵襲模型上,可見大量細胞骨架的重排,同時也發(fā)現(xiàn)AIF1L被募集到細胞片狀偽足。也有研究發(fā)現(xiàn)AIF1L是足細胞特異表達基因,使用siRNA沉默AIF1L,會導致F-actin壓力纖維明顯的缺失和重排,同時伴隨CD2AP和SYNPO的表達下調(diào),兩者對維持足細胞骨架的穩(wěn)定性尤為重要。這些研究表明AIF1L參與細胞骨架結(jié)構(gòu)的調(diào)控,但其在腫瘤中的作用尚不清楚。到目前為止,尚未發(fā)現(xiàn)AIF1L在乳腺癌中表達的表型特征,其對乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的影響以及相關(guān)分子機制尚不清楚,本研究利用公共數(shù)據(jù)庫分析了AIF1L表達特征,并分析預測了其生物學功能,在此基礎上,進一步觀察了AIF1L在乳腺癌組織中的表達特征,分析了AIF1L與乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的關(guān)系,并探討了相關(guān)分子機制。研究方法:1、采用生物信息學方法評估AIF1L在TCGA、HPA、GEO數(shù)據(jù)庫中乳腺癌組織的表達,通過DAVID和GSEA分析CCLE數(shù)據(jù)庫,推測AIF1L基因的生物學功能及其相關(guān)信號通路。2、采用免疫組織化學染色方法檢測287例乳腺癌組織及44例癌旁非癌組織中AIF1L的表達,并分析其與乳腺癌臨床病理相關(guān)因素和患者預后的關(guān)系。3、使用攜帶AIF1L基因(或?qū)φ?的腺病毒載體轉(zhuǎn)染MDAMB231細胞,通過MTT實驗和平板克隆形成實驗,評估AIF1L基因?qū)DAMB231細胞增殖能力和干性的影響;通過劃痕愈合實驗、Transwell遷移侵襲實驗,評估AIF1L基因?qū)DAMB231細胞遷移和侵襲能力的影響;通過細胞伸展實驗,評估AIF1L基因?qū)DAMB231細胞形態(tài)的影響。采用Western blot方法評價AIF1L基因?qū)AK-RhoA信號通路及EMT相關(guān)信號通路的影響。4、實驗所得數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件或R語言軟件等分析,實驗圖片處理采用ImageJ軟件,采用Graphpad軟件繪制圖表。計數(shù)資料采用行×列表的χ2檢驗或Fisher精確檢驗,生存分析采用Kaplan-Meier及l(fā)og-Rank檢驗,多因素生存分析采用Cox回歸分析。檢驗水平α=0.05。結(jié)果:1、TCGA數(shù)據(jù)庫乳腺癌中AIF1L mRNA的表達明顯低于正常組織,而乳腺癌中甲基化水平高于正常組織。2、HPA數(shù)據(jù)庫中AIF1L主要表達于腺上皮細胞的細胞漿和細胞膜,且正常組織較乳腺癌組織表達高。3、GEO數(shù)據(jù)庫中AIF1L在腫瘤中表達均低于正常對照組。4、DAVID分析和GSEA分析提示AIF1L基因與緊密連接、細胞骨架、細胞粘附等信號通路相關(guān)。5、AIF1L的陽性免疫反應主要定位于細胞膜和細胞漿。乳腺癌中AIF1L的表達率(28.6%,82/287)顯著低于癌旁非癌組織中的陽性率(58.3%,28/48)(p=0.007)。AIF1L在三陰性乳腺癌中表達較低。AIF1L低表達組與高表達組相比預后差,AIF1L高表達是乳腺癌預后的保護因素。6、AIF1L基因可抑制MDAMB231細胞增殖能力、克隆形成能力、細胞遷移及侵襲能力以及細胞伸展水平,該作用可能是通過抑制FAK-RhoA信號通路蛋白表達及活化,逆轉(zhuǎn)癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT表型而實現(xiàn)。結(jié)論:1、生物信息學分析發(fā)現(xiàn)人乳腺癌組織中AIF1L的表達明顯低于正常組織,且在三陰性乳腺癌中表達最低;AIF1L參與多種信號通路,如緊密連接、細胞粘附、細胞骨架調(diào)節(jié)等,其可能在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的生物學功能。2、免疫組化研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中AIF1L蛋白表達顯著低于癌旁非癌組織;AIF1L在三陰性乳腺癌組織顯著降低。AIF1L高表達的乳腺癌患者預后明顯好于AIF1L低表達患者,AIF1L高表達是乳腺癌患者的保護性預后因素。3、AIF1L可能通過抑制FAK-RhoA信號通路,抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)通路,進而抑制癌細胞的遷移和侵襲,發(fā)揮抑癌基因的作用。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

圖 1.1 腫瘤細胞系的百科全書（CCLE）中細胞來源分類59 種細胞系詳細信息見表 1.1。腫瘤細胞系來自于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen )，美國模式菌種收集中心(ATCC，American type culture collection)和日本生物資源收集中心(JCRB，Japanese Collection of Research Bioresources)細胞庫，永生化的乳腺上皮細胞 HMEL來自于 Achilles 實驗室。細胞系相關(guān)信息來自于各個網(wǎng)站或者查詢文獻獲得[17-20]。表 1.1 CCLE 數(shù)據(jù)庫中乳腺細胞系及其特征CCLE 名字 細胞系 分子分型 組織學類型 來源AU565_BREAST AU565 HER2amp ATCCBT20_BREAST BT-20 TNBC ductal_carcinoma ATCCBT474_BREAST BT-474 HER2amp ductal_carcinoma ATCCBT483_BREAST BT-483 Luminal ductal_carcinoma ATCCBT549_BREAST BT-549 TNBC ductal_carcinoma ATCCCAL120_BREAST CAL-120 Luminal B DSMZCAL148_BREAST CAL-148 Luminal A ductal_carcinoma DSMZCAL51_BREAST CAL-51 DSMZ

3 結(jié)果3.1 HPA 數(shù)據(jù)庫中 AIF1L 蛋白的表達通過檢索 HPA 數(shù)據(jù)庫 AIF1L 在多種組織中的表達，免疫組織化學結(jié)果發(fā)現(xiàn)AIF1L 在腎臟中腎小球和腎小管均高表達，在子宮內(nèi)膜腺管、乳腺導管上皮、貯精囊腺上皮和附睪腺上皮、大腦皮層的內(nèi)皮細胞、皮膚的生黑色素細胞和表皮細胞、尾狀核的神經(jīng)細胞、甲狀腺上皮細胞、甲狀旁腺上皮細胞、結(jié)腸腺上皮細胞、唾液腺上皮細胞等中-低表達，其他組織多為陰性，偶可見極低表達，見圖 1.2。另外在脾臟紅髓和白髓的免疫細胞中未見 AIF1L 的表達，但于內(nèi)皮細胞中呈強表達。而AIF1 主要表達于骨髓及免疫系統(tǒng)中的免疫細胞，如闌尾、骨髓中造血細胞、淋巴結(jié)、扁桃體和脾臟紅髓，見圖 1.3。肺臟巨噬細胞中 AIF1 也存在高表達。AIF1 和 AIF1L在脾臟中的表達見圖 1.4。

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