發(fā)布時間：2020-07-02 23:28

【摘要】：大豆,我國重要的糧食和油料作物,通過大豆所制的豆制品等在我國國民飲食中占有極大比重,也是很好油脂與蛋白的營養(yǎng)來源~([1])。由于我國農(nóng)產(chǎn)品、糧食作物等耕作面積受到土壤鹽堿化威脅,導(dǎo)致這些農(nóng)產(chǎn)品、糧食作物生長發(fā)育不能正常進行,造成產(chǎn)量損失嚴(yán)重。目前,如何減少作物遭受鹽堿的威脅,提高植物耐鹽堿性已成為作物育種工作的首要任務(wù)之一。鑒于傳統(tǒng)大豆育種培育耐鹽堿種質(zhì)資源匱乏,難以對產(chǎn)量及性狀進行綜合改良,并且難以提高大豆耐鹽堿特性。目前,轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅猛并且趨于成熟,結(jié)合分子生物學(xué)不僅可以對植物遺傳性狀進行定向改良,而且會因此豐富了耐鹽堿基因資源。通過基因工程中轉(zhuǎn)基因技術(shù)與常規(guī)育種的有效集成,是有效地解決大豆育種困難并且增強大豆抗鹽堿能力,增強并改善大豆育種的重要手段。本研究將酵母耐鹽堿基因ScHAL1與玉米耐鹽堿基因ZmHKT導(dǎo)入大豆栽培品種Bert中,結(jié)合分子檢測獲得陽性轉(zhuǎn)基因植物ScHAL145株與ZmHKT 40株,經(jīng)耐鹽性鑒定(耐1.5%NaCl),篩選出耐鹽性狀較好的轉(zhuǎn)HAL1大豆轉(zhuǎn)基因新材料9份,轉(zhuǎn)HKT大豆轉(zhuǎn)基因新材料7份。為耐鹽堿轉(zhuǎn)基因大豆育種奠定了較好的基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:本研究將酵母與玉米耐鹽基因ScHAL1與ZmHKT分別構(gòu)建到植物表達載體pCAMBIA3301與pCAMBIA3300上,獲得植物表達載體pCAMBIA3301-HAL1與pCAMBIA3300-HKT。選用轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定、體系完整的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法進行大豆遺傳轉(zhuǎn)化,選用轉(zhuǎn)化效率較高且對農(nóng)桿菌敏感的Bert大豆品種作為受體材料,將酵母HAL1基因與玉米HKT基因?qū)氲酱蠖怪�。對陽性轉(zhuǎn)基因植株進行Bar基因試紙條、PCR、RT-PCR、Southern雜交等分子方面的檢測及耐鹽性鑒定。實驗共對5200個大豆子葉節(jié)外植體進行侵染,轉(zhuǎn)化后的再生植株通過PCR與Southern分子檢測后分別獲得含有耐鹽基因ScHAL1轉(zhuǎn)基因陽性植株45株,耐鹽基因ZmHKT轉(zhuǎn)基因陽性植株40株。鑒定出耐鹽(耐1.5%NaCl)性狀較好的大豆轉(zhuǎn)基因材料ScHAL1 9份,ZmHKT 7份。1.植物表達載體的構(gòu)建。以HAL1基因兩端序列為模版設(shè)計引物,引物兩端加上Noc I和Best EII酶切位點,對目的片段HAL1基因進行PCR擴增。膠回收目的片段。提取pCAMBIA3301質(zhì)粒,用Noc I和Best EII限制性內(nèi)切酶酶切pCAMBIA3301質(zhì)粒,用T4連接酶將HAL1片段連接到pCAMBIA3301載體上,構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA3301-HAL1。以HKT兩端序列為模版設(shè)計引物,引物兩端加上Bam HI和Sac I酶切位點,對目的片段HKT進行PCR擴增。膠回收目的片段。提取pCAMBIA3300質(zhì)粒,用Bam HI和Sac I限制性內(nèi)切酶酶切pCAMBIA3300質(zhì)粒,用T4連接酶將HKT片段連接到pCAMBIA3300載體上,構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA3300-HKT。選用凍融法導(dǎo)入,取構(gòu)建好的載體pCAMBIA3301-HAL1與pCAMBIA3300-HKT導(dǎo)入到EHA105農(nóng)桿菌中,保存以備用來進行大豆遺傳轉(zhuǎn)化試驗。2.大豆的遺傳轉(zhuǎn)化。本研究選用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大豆的方法,將ScHAL1基因與ZmHKT基因?qū)氲酱蠖笲ert中。本研究侵染大豆子葉節(jié)外植體5200粒,芽的誘導(dǎo)率為91%,芽伸長率為27%,生根率為80%,轉(zhuǎn)化率為2.5%。獲得HAL1轉(zhuǎn)基因植株45株,HKT轉(zhuǎn)基因植株40株。3.轉(zhuǎn)基因植株分子檢測。分別以ScHAL1基因與ZmHKT基因設(shè)計引物并對轉(zhuǎn)化得到的大豆植株進行PCR、RT-PCR、Southern等生化分子的鑒定及Bar蛋白試紙條快速鑒定,證明ScHAL1與ZmHKT基因通過遺傳轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化方法已成功在大豆的基因組中整合并表達。4.芽期和苗期耐鹽性鑒定。分子檢測后對成功轉(zhuǎn)入ScHAL1基因與ZmHKT基因的陽性轉(zhuǎn)基因植株進行芽期和苗期耐鹽性鑒定。通過陽性植株與非轉(zhuǎn)基因植株對鹽水澆灌(1.5%NaCl)的耐受性對比,鑒定出耐鹽性良好的轉(zhuǎn)基因植株。
【學(xué)位授予單位】：長春師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S565.1
【圖文】：

圖 2.1 pCAMBIA3301-HAL1 植物表達載體圖譜Fig2.1 pCAMBIA3301-HAL1 expression vector construction ma表 2.1 HAL1 外源 T-DNA 插入序列元件及長度b2.1 HAL1 exogenous T-DNA insertion sequence element and le插入序列元件名稱 長度

20圖 2.2 pCAMBIA3300-HKT 植物表達載體圖譜Fig2.2pCAMBIA3300-HKT expression vector construction map

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2738826