【摘要】：卷丹(Lilium lancifolium),又稱(chēng)宜興百合、虎皮百合,百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)植物,分布于中國(guó)17個(gè)省區(qū)。該種花大色艷,抗性強(qiáng),兼具觀(guān)賞、食用、藥用價(jià)值,為我國(guó)傳統(tǒng)食用百合和藥用百合的主要種類(lèi)之一。卷丹是天然的三倍體,不產(chǎn)生種子,但在莖的中上部葉腋處可產(chǎn)生紫黑色珠芽。珠芽繁殖不僅能較好地保留母體的遺傳特征,且較鱗片扦插和籽球繁殖簡(jiǎn)便,繁殖效率高,因此成為卷丹種群擴(kuò)展最主要的繁殖策略。目前,關(guān)于植物珠芽形成的信息較少。在百合中僅見(jiàn)于解剖學(xué)等方面一些初步研究,盡管有些與珠芽形成相關(guān)的基因被克隆,但百合珠芽是如何形成的,為何珠芽?jī)H著生于莖中上部的葉腋處,珠芽發(fā)生涉及到哪些基因和代謝通路等一系列科學(xué)問(wèn)題均未得到很好研究,至今,其形成機(jī)理尚不清楚。本研究以三倍體卷丹為試驗(yàn)材料,通過(guò)對(duì)其珠芽形成過(guò)程的解剖學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、生理學(xué)等進(jìn)行分析,系統(tǒng)地探索研究了調(diào)控珠芽形成的機(jī)制,在此基礎(chǔ)上,篩選出珠芽形成相關(guān)的基因進(jìn)行了全長(zhǎng)克隆及生物信息分析,以期為人工調(diào)控珠芽形成,有效提高百合繁殖系數(shù)奠定理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.卷丹珠芽形成的形態(tài)學(xué)與解剖學(xué)研究。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、石蠟切片法對(duì)卷丹珠芽的發(fā)生規(guī)律及形成過(guò)程的解剖結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了研究。結(jié)果表明卷丹珠芽形成于地上莖與葉片連接的葉腋處,是由葉腋處葉柄基部近軸側(cè)表皮下層的薄壁細(xì)胞分裂分化而來(lái)。葉柄基部近軸端凸起,定義為珠芽的啟動(dòng),是卷丹珠芽形成過(guò)程的首個(gè)重要變化。卷丹珠芽首先在莖上部某一葉腋處形成,之后其上位葉依次形成珠芽。2.卷丹珠芽形成過(guò)程中激素和糖代謝研究。通過(guò)蒽酮比色法對(duì)卷丹珠芽形成過(guò)程不同階段的上、下葉腋中的淀粉和可溶性糖含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果顯示上葉腋中淀粉含量高于下葉腋,且在上部葉腋珠芽啟動(dòng)過(guò)程中,可溶性糖含量下降,而淀粉含量上升。通過(guò)酶聯(lián)免疫法測(cè)定了IAA、ZR、ABA和GAs在卷丹珠芽形成過(guò)程中的含量變化,結(jié)果顯示,生長(zhǎng)素的變化最為顯著,在珠芽啟動(dòng)時(shí)含量上升,后期形成階段含量下降,而ZR和ABA在珠芽形成過(guò)程中含量下降,GAs則在啟動(dòng)和形成過(guò)程中,含量緩慢增加。3.卷丹珠芽形成轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的序列拼接、基因功能注釋和分類(lèi)。利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)卷丹珠芽形成過(guò)程的三個(gè)階段(S1:莖上部葉腋未長(zhǎng)珠芽;S2:莖上部葉腋凸起;S3:莖上部葉腋剛形成珠芽結(jié)構(gòu))的莖上部葉腋組織及S2階段的下部葉腋進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,最終獲得64,971萬(wàn)個(gè)raw reads,過(guò)濾后得到59,806萬(wàn)個(gè)clean reads,進(jìn)行De novo拼接后獲得389,636個(gè)contigs和293,858個(gè)非冗余的unigenes,平均讀長(zhǎng)549 bp,N50為752 bp。對(duì)Unigenes進(jìn)行功能注釋和分類(lèi),GO分類(lèi)將67,672個(gè)unigenes分為56個(gè)功能組。COG將36,214個(gè)unigenes分為26類(lèi)。KEGG分類(lèi)將34,491個(gè)unigenes歸于132個(gè)具體的通路。4.差異表達(dá)基因的篩選及功能富集分析。將卷丹上葉腋珠芽形成的三個(gè)階段進(jìn)行兩兩比較,并對(duì)S2階段的上葉腋與下葉腋進(jìn)行比較,共得到11,871個(gè)差異表達(dá)基因。差異基因的表達(dá)主要發(fā)生于珠芽形成的啟動(dòng)階段,且珠芽的啟動(dòng)多為上調(diào)基因作用的結(jié)果。對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集,結(jié)果表明上葉腋珠芽的啟動(dòng)和形成主要富集于代謝過(guò)程,而上、下葉腋的差異基因主要富集于分子功能組中的催化活性及生物過(guò)程中的淀粉代謝過(guò)程、蔗糖代謝過(guò)程和蛋白質(zhì)磷酸化。差異表達(dá)基因的KEGG富集結(jié)果顯示,淀粉和糖代謝通路及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在珠芽形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。珠芽的啟動(dòng)伴隨著淀粉的合成。植物激素在不同的樣品中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。其中生長(zhǎng)素與珠芽的啟動(dòng)呈正相關(guān),但抑制卷丹珠芽的進(jìn)一步形成。5.卷丹LlAGO1基因的克隆與生物信息學(xué)分析。利用卷丹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的基因片段信息,篩選出注釋為AGO1的差異表達(dá)基因,根據(jù)該基因的保守序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)RACE技術(shù)從卷丹中分離到AGO1基因,命名為L(zhǎng)lAGO1。LlAGO1全長(zhǎng)4014 bp,其中開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)3684 bp,編碼1227個(gè)氨基酸殘基,其編碼蛋白分子量為135.36 kD,理論等電點(diǎn)(pI)為9.57。LlAGO1與相關(guān)同源蛋白高度相似,且與蘆筍AGO1a蛋白(XP_020260210.1)親緣關(guān)系最近。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明,LlAGO1為不穩(wěn)定的親水的非分泌蛋白,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu),不能形成卷曲螺旋;氨基酸序列分析表明LlAGO1含有PAZ和PIWI兩個(gè)AGO1典型的結(jié)構(gòu)域;亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明主要定位于細(xì)胞核;預(yù)測(cè)其可能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。6.LlAGO1基因的表達(dá)分析。qRT-PCR分析結(jié)果表明LlAGO1在卷丹葉腋、鱗片、根、葉片等不同組織部位均有表達(dá),其中在葉腋中的表達(dá)量最高,根中的表達(dá)量最低。此外,卷丹LlAGO1基因的表達(dá)具有時(shí)空性,即LlAGO1僅在卷丹可形成珠芽的上部葉腋表達(dá),且在珠芽形成過(guò)程中表達(dá)量逐漸升高,而在不形成珠芽的下部葉腋幾乎不表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：南京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S682.29

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2738197