【摘要】：研究背景和目的食管癌是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤,全世界每年約有20萬人死于食管癌,對(duì)人類的生命和健康造成極大威脅。食管癌的病因尚未完全明了,通過多途徑探索,發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與遺傳因素、亞硝胺慢性刺激、炎癥及創(chuàng)傷、糧食和蔬菜中的微量元素含量等相關(guān),但其確切致病機(jī)制有待深入研究。EC9706細(xì)胞是來源于食管癌組織的細(xì)胞株,在體外以EC9706細(xì)胞為研究對(duì)象,對(duì)于探討和認(rèn)識(shí)食管癌的生物學(xué)行為有重要的價(jià)值。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族(serine protease inhibitor kazal type,SPINK),成員包括SPINK1~12等多個(gè)亞族,該家族成員多與疾病和腫瘤相關(guān),如spink1與胰腺癌相關(guān),spink2與男性不育相關(guān),spink7為食管癌相關(guān)基因等。spink7已被證實(shí)為腫瘤抑制基因,具有調(diào)控細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡及抑制腫瘤遷移和侵襲等功能。以往的研究發(fā)現(xiàn),食管組織內(nèi)有SPINK8蛋白的內(nèi)源性表達(dá),同時(shí)另一項(xiàng)全基因組比對(duì)結(jié)果顯示,spink8基因相對(duì)表達(dá)量在成人食管癌組織比正常食管及癌旁組織明顯減少。但有關(guān)SPINK8蛋白的功能研究國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道甚少。spink8與spink7具有同源性,且模擬三維結(jié)構(gòu)相似,但兩種蛋白的氨基酸序列有部分差異,推測(cè)這兩種蛋白特異性抑制的蛋白酶可能有所不同。本研究將根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫記錄的spink8 c DNA序列構(gòu)建能夠表達(dá)sh RNA的重組質(zhì)粒,并應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo),將干擾重組質(zhì)粒和過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞,觀察EC9706細(xì)胞中spink8基因的表達(dá)情況,并討論沉默spink8內(nèi)源性基因及過表達(dá)SPINK8蛋白對(duì)EC9706細(xì)胞增殖、遷移和克隆形成能力的影響。實(shí)驗(yàn)將探索spink8是否屬于抑癌基因,并初步闡述其作用方式,為食管癌的發(fā)生發(fā)展提供可能得新的理論機(jī)制,以求為治療提供新的作用靶點(diǎn)。材料和方法1.以spink8的m RNA已知序列為靶點(diǎn),構(gòu)建p Genesil-SPINK8重組質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒。2.重組干擾質(zhì)粒p Genesil-SPINK8、陰性對(duì)照質(zhì)粒、重組過表達(dá)載體p EGFP-C1-SPINK8和空質(zhì)粒p EGFP-C1分別轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞株,細(xì)胞分為5組,即未處理組、干擾組、陰性對(duì)照組、空載體組和過表達(dá)組,分別用半定量RT-PCR和Western Blotting檢測(cè)對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行鑒定。3.繪制MTT生長(zhǎng)曲線檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力。4.克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞克隆形成能力。5.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的體外遷移能力。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均由SPSS17.0軟件處理,定量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示;多組均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析(ANOVA),并用LSD-t法進(jìn)行組間比較;以α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1.成功構(gòu)建p Genesil-SPINK8重組質(zhì)粒,并且應(yīng)用限制性內(nèi)切酶SalⅠ進(jìn)行消化,證實(shí)重組質(zhì)粒能被切出長(zhǎng)約400 bp的小帶;測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的完全相符。2.p Genesil-SPINK8重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞后,RT-PCR檢測(cè)和Western Blotting結(jié)果顯示,spink8在m RNA和蛋白的表達(dá)水平均受到明顯抑制(P0.05)。3.p EGFP-C1-SPINK8重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞后,RT-PCR檢測(cè)和Western Blotting結(jié)果顯示,spink 8在m RNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯提高(P0.05)。4.MTT生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示,過表達(dá)SIPNK8蛋白能夠抑制EC9706細(xì)胞增殖,而干擾其表達(dá)后細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。5.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)SPINK8蛋白的EC9706細(xì)胞體外克隆形成能力下降,而干擾其表達(dá)后克隆形成能力提高。6.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)SPINK8蛋白的EC9706細(xì)胞體外遷移能力降低,而干擾其表達(dá)量后的細(xì)胞遷移速率加快。結(jié)論1.成功構(gòu)建p Genesil-SPINK8重組質(zhì)粒。2.合成的si RNA能夠有效抑制EC9706細(xì)胞SPINK8蛋白的內(nèi)源性表達(dá)。3.spink8基因?qū)C9706細(xì)胞的增殖及克隆形成能力具有一定的抑制作用。4.spink8基因?qū)C9706細(xì)胞體外遷移能力具有一定的抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 高冬玲;張紅新;陳奎生;張嵐;宋一民;張?jiān)茲h;;小分子干擾RNA對(duì)EC9706細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C表達(dá)的影響[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年06期

2 王曉蘭;王淑英;王建剛;;壁虎醇提物對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞EC9706的作用和體內(nèi)抗腫瘤活性[J];中國(guó)中藥雜志;2010年16期

3 張紅波;屈二軍;楊海波;宋巍;陳蘭英;;韭籽多糖對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J];癌變.畸變.突變;2013年06期

4 趙秋民,陳奎生,溫洪濤,王忠民,高冬玲,張?jiān)茲h,張嵐,宋一民;應(yīng)用完整原位雜交技術(shù)檢測(cè)人食管癌EC9706細(xì)胞中胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體mRNA的表達(dá)[J];中國(guó)臨床康復(fù);2005年22期

5 郝炳章;馮常煒;盧丹;;姜黃素對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞增殖及侵襲的影響[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志;2011年01期

6 陳蘭英;宋巍;楊海波;于淮濱;劉亞軍;支雙成;楊峰;;大蒜素對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用[J];癌變·畸變·突變;2013年03期

7 韓亞玲;馮彥斌;羅曼莉;徐昕;蔡巖;王明榮;;人食管癌EC9706單克隆的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究[J];遺傳;2007年11期

8 金偉;董濤;欒春艷;趙存新;張銀華;;辛伐他汀對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖及核因子κB的影響[J];中國(guó)腫瘤臨床;2010年14期

9 焦峰;黃海進(jìn);;紫檀芪對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制[J];西南國(guó)防醫(yī)藥;2012年08期

10 王濤;董子明;趙國(guó)強(qiáng);;調(diào)控食管癌EC9706細(xì)胞DNA聚合酶β表達(dá)的初步研究[J];中國(guó)病理生理雜志;2010年08期

相關(guān)會(huì)議論文 前7條

1 陳蘭英;楊海波;孫婕;謝朝暉;張紅波;;人食管癌EC9706細(xì)胞凋亡前后核基質(zhì)蛋白的提取與分析[A];低碳生活與健康損害論壇——中國(guó)環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)專業(yè)委員會(huì)全國(guó)第十三屆學(xué)術(shù)會(huì)議暨第四屆第5次委員會(huì)會(huì)議論文集[C];2011年

2 陳蘭英;宋巍;楊海波;于淮濱;劉亞軍;支雙成;楊峰;;大蒜素對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響[A];第十四屆中國(guó)科協(xié)年會(huì)第17分會(huì)場(chǎng)：環(huán)境危害與健康防護(hù)研討會(huì)論文集[C];2012年

3 王少康;孫桂菊;楊磊;李莉華;;維生素D_3對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響[A];營(yíng)養(yǎng)與慢性病——中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)第七屆理事會(huì)青年工作委員會(huì)第一次學(xué)術(shù)交流會(huì)議論文集[C];2010年

4 王俊玲;鄭乃剛;吳景蘭;楊勝利;;納米脂質(zhì)體槲皮素聯(lián)合丁酸鈉對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞增殖的作用[A];低碳生活與健康損害論壇——中國(guó)環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)專業(yè)委員會(huì)全國(guó)第十三屆學(xué)術(shù)會(huì)議暨第四屆第5次委員會(huì)會(huì)議論文集[C];2011年

5 吳叢梅;黃天華;謝慶東;吳德生;徐小虎;;pEgr-P16重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在人食管癌EC9706細(xì)胞中的輻射誘導(dǎo)表達(dá)[A];中國(guó)的遺傳學(xué)研究——中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)第七次代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編[C];2003年

6 張紅新;尹玉慧;陳奎生;高冬玲;宋一民;張?jiān)茲h;;siRNA抑制食管癌EC9706細(xì)胞VEGF-C體外表達(dá)的定量研究[A];第十二屆中國(guó)體視學(xué)與圖像分析學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

7 章旭耀;石曉靜;馬永成;陳冬;王冉;劉宏民;;抗腫瘤新藥JD27通過線粒體途徑誘導(dǎo)食管癌EC9706細(xì)胞凋亡[A];2013醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十三屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李揚(yáng);白藜蘆醇對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞周期和凋亡的影響及其作用機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

2 孫艷;spink8基因?qū)κ彻馨〦C9706細(xì)胞增殖及遷移的抑制作用[D];鄭州大學(xué);2016年

3 劉用金;特異核基質(zhì)蛋白在人食管癌EC9706細(xì)胞凋亡中作用的初步研究[D];廈門大學(xué);2009年

4 宋建曄;姜黃素誘導(dǎo)食管癌EC9706細(xì)胞凋亡過程中核基質(zhì)蛋白的表達(dá)變化[D];廈門大學(xué);2009年

5 郝炳章;姜黃素對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞增殖、侵襲的影響[D];鄭州大學(xué);2011年

6 劉曉東;GDC-0941誘導(dǎo)人食管癌EC9706細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)制的研究[D];鄭州大學(xué);2013年

7 曹靜;HIF-1α表達(dá)與食管癌細(xì)胞株EC9706凋亡和增殖關(guān)系的研究[D];鄭州大學(xué);2006年

8 魏文啟;沉默食管癌EC9706細(xì)胞CD147表達(dá)的初步研究[D];鄭州大學(xué);2009年

9 楊娟;TSC2反義寡核苷酸對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞增殖、凋亡的影響[D];鄭州大學(xué);2011年

10 胡嬋麗;葉黃素對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)分化效應(yīng)及機(jī)制研究[D];鄭州大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2739367