【摘要】：研究背景和目的食管癌是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤,全世界每年約有20萬人死于食管癌,對人類的生命和健康造成極大威脅。食管癌的病因尚未完全明了,通過多途徑探索,發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與遺傳因素、亞硝胺慢性刺激、炎癥及創(chuàng)傷、糧食和蔬菜中的微量元素含量等相關(guān),但其確切致病機(jī)制有待深入研究。EC9706細(xì)胞是來源于食管癌組織的細(xì)胞株,在體外以EC9706細(xì)胞為研究對象,對于探討和認(rèn)識食管癌的生物學(xué)行為有重要的價值。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族(serine protease inhibitor kazal type,SPINK),成員包括SPINK1~12等多個亞族,該家族成員多與疾病和腫瘤相關(guān),如spink1與胰腺癌相關(guān),spink2與男性不育相關(guān),spink7為食管癌相關(guān)基因等。spink7已被證實為腫瘤抑制基因,具有調(diào)控細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡及抑制腫瘤遷移和侵襲等功能。以往的研究發(fā)現(xiàn),食管組織內(nèi)有SPINK8蛋白的內(nèi)源性表達(dá),同時另一項全基因組比對結(jié)果顯示,spink8基因相對表達(dá)量在成人食管癌組織比正常食管及癌旁組織明顯減少。但有關(guān)SPINK8蛋白的功能研究國內(nèi)外文獻(xiàn)報道甚少。spink8與spink7具有同源性,且模擬三維結(jié)構(gòu)相似,但兩種蛋白的氨基酸序列有部分差異,推測這兩種蛋白特異性抑制的蛋白酶可能有所不同。本研究將根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫記錄的spink8 c DNA序列構(gòu)建能夠表達(dá)sh RNA的重組質(zhì)粒,并應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo),將干擾重組質(zhì)粒和過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞,觀察EC9706細(xì)胞中spink8基因的表達(dá)情況,并討論沉默spink8內(nèi)源性基因及過表達(dá)SPINK8蛋白對EC9706細(xì)胞增殖、遷移和克隆形成能力的影響。實驗將探索spink8是否屬于抑癌基因,并初步闡述其作用方式,為食管癌的發(fā)生發(fā)展提供可能得新的理論機(jī)制,以求為治療提供新的作用靶點。材料和方法1.以spink8的m RNA已知序列為靶點,構(gòu)建p Genesil-SPINK8重組質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒。2.重組干擾質(zhì)粒p Genesil-SPINK8、陰性對照質(zhì)粒、重組過表達(dá)載體p EGFP-C1-SPINK8和空質(zhì)粒p EGFP-C1分別轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞株,細(xì)胞分為5組,即未處理組、干擾組、陰性對照組、空載體組和過表達(dá)組,分別用半定量RT-PCR和Western Blotting檢測對蛋白表達(dá)水平進(jìn)行鑒定。3.繪制MTT生長曲線檢測轉(zhuǎn)染后各實驗組細(xì)胞的增殖能力。4.克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染后各實驗組的細(xì)胞克隆形成能力。5.劃痕愈合實驗檢測轉(zhuǎn)染后各實驗組細(xì)胞的體外遷移能力。6.統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均由SPSS17.0軟件處理,定量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示;多組均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析(ANOVA),并用LSD-t法進(jìn)行組間比較;以α=0.05為顯著性檢驗水準(zhǔn)。結(jié)果1.成功構(gòu)建p Genesil-SPINK8重組質(zhì)粒,并且應(yīng)用限制性內(nèi)切酶SalⅠ進(jìn)行消化,證實重組質(zhì)粒能被切出長約400 bp的小帶;測序結(jié)果與設(shè)計的完全相符。2.p Genesil-SPINK8重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞后,RT-PCR檢測和Western Blotting結(jié)果顯示,spink8在m RNA和蛋白的表達(dá)水平均受到明顯抑制(P0.05)。3.p EGFP-C1-SPINK8重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞后,RT-PCR檢測和Western Blotting結(jié)果顯示,spink 8在m RNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯提高(P0.05)。4.MTT生長曲線結(jié)果顯示,過表達(dá)SIPNK8蛋白能夠抑制EC9706細(xì)胞增殖,而干擾其表達(dá)后細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。5.克隆形成實驗結(jié)果顯示,過表達(dá)SPINK8蛋白的EC9706細(xì)胞體外克隆形成能力下降,而干擾其表達(dá)后克隆形成能力提高。6.劃痕實驗結(jié)果顯示,過表達(dá)SPINK8蛋白的EC9706細(xì)胞體外遷移能力降低,而干擾其表達(dá)量后的細(xì)胞遷移速率加快。結(jié)論1.成功構(gòu)建p Genesil-SPINK8重組質(zhì)粒。2.合成的si RNA能夠有效抑制EC9706細(xì)胞SPINK8蛋白的內(nèi)源性表達(dá)。3.spink8基因?qū)C9706細(xì)胞的增殖及克隆形成能力具有一定的抑制作用。4.spink8基因?qū)C9706細(xì)胞體外遷移能力具有一定的抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

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本文編號：2739367