【摘要】：紫杉醇是一種廣譜、高效、低毒的抗癌藥物。產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌是重要的紫杉醇藥源之一。但目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌存在紫杉醇產(chǎn)量低等問(wèn)題,尚無(wú)法實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化應(yīng)用。高表達(dá)真菌的紫杉醇合成限速酶基因和調(diào)控基因,構(gòu)建紫杉醇穩(wěn)定高產(chǎn)的基因工程菌株是實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化應(yīng)用的主要途徑之一。但目前真菌紫杉醇合成途徑及其相關(guān)基因的研究極少,嚴(yán)重限制了高產(chǎn)工程菌株的創(chuàng)建。因此,克隆真菌紫杉醇合成相關(guān)基因并研究其功能,已成為利用基因工程技術(shù)提高真菌紫杉醇產(chǎn)量的關(guān)鍵。本研究以產(chǎn)紫杉醇真菌枝狀枝孢霉(簡(jiǎn)稱:枝霉)(Cladosporium cladosporioides)MD2為對(duì)象,選取了2個(gè)候選基因A11450和A02725,克隆了A02725并對(duì)A02725進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,分別構(gòu)建了這兩個(gè)候選基因的超表達(dá)載體,并獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因菌株,通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因菌株中紫杉烷類的合成情況,分析了超表達(dá)候選基因A11450和A02725對(duì)宿主紫杉烷合成的影響,為深入揭示這兩個(gè)基因的功能以及高產(chǎn)菌株的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:(1)克隆了候選基因A02725的DNA全長(zhǎng)序列并采用多個(gè)在線軟件對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)。候選基因A02725的DNA全長(zhǎng)序列為1524 bp,不含內(nèi)含子,其編碼蛋白與Cercospora zeina的r{牛兒r{牛兒焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)一致性為62%,該蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu),無(wú)信號(hào)肽,含有聚戊烯基合成(Polypentenyl synthetic)結(jié)構(gòu)域。(2)以pTFCM為基本框架構(gòu)建了候選基因A11450的超表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化枝霉MD2,成功獲得了A11450-轉(zhuǎn)基因菌株25株。采用Southern blot技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因菌株中外源基因的拷貝數(shù),并隨機(jī)選擇了三株外源基因以單拷貝方式整合的A11450-轉(zhuǎn)基因菌株4-6、4-19及4-20,QRT-PCR檢測(cè)候選基因A11450的表達(dá)量,然后選取基因表達(dá)量相對(duì)最高的4-20菌株提取紫杉烷類產(chǎn)物進(jìn)行了HPLC分析。結(jié)果表明,A11450-轉(zhuǎn)基因菌株的10-去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III及紫杉醇產(chǎn)量是對(duì)照菌株(未轉(zhuǎn)基因菌株)的1.24-1.36倍;說(shuō)明超表達(dá)候選基因A11450可提高枝霉MD2 10-去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III及紫杉醇的產(chǎn)量。(3)構(gòu)建了候選基因A02725的超表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化枝霉MD2,共獲得A02725-轉(zhuǎn)基因菌株18株。Southern blot驗(yàn)證候選基因A02725的拷貝數(shù)。隨機(jī)選擇三株外源基因以單拷貝方式整合的A02725-轉(zhuǎn)基因菌株7-10、7-14及7-18,并采用QRT-PCR檢測(cè)候選基因A02725的表達(dá)量,結(jié)果表明7-18菌株的A02725相對(duì)表達(dá)量最高。HPLC分析7-18菌株的三種紫杉烷類,結(jié)果表明A02725-轉(zhuǎn)基因菌株的10-去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III及紫杉醇產(chǎn)量是對(duì)照菌株的1.34-1.44倍;說(shuō)明超表達(dá)候選基因A02725可提高枝霉MD2的三種紫杉烷類的產(chǎn)量。以上結(jié)果初步揭示超表達(dá)候選基因A11450和A02725可促進(jìn)枝霉MD2的三種紫杉烷類的合成,為后期通過(guò)基因敲除分析以及體外催化功能分析深入揭示這兩個(gè)基因的功能奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q93;Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 邱德有;張彬;楊艷芳;邵芬娟;滕文靜;;紫杉醇生物合成研究歷史、現(xiàn)狀及展望[J];生物技術(shù)通報(bào);2015年04期

2 婁靜;牛學(xué)良;顏菲;潘皎;朱旭東;;真菌紫杉醇/烷研究近況[J];菌物學(xué)報(bào);2011年02期

3 肖明貴,余龍江,劉智,程華,向福,周智德;曼地亞紅豆杉植株中GGPP合成酶的克隆與分析[J];中國(guó)生物工程雜志;2004年02期

本文編號(hào)：2738167