【摘要】：為了驗(yàn)證小麥籽粒大小相關(guān)基因TaCYP78A5在小麥籽粒發(fā)育中的功能,對(duì)pINO啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的TaCYP78A5基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小麥后代株系進(jìn)行了鑒定,檢測了T_0代植株目標(biāo)基因拷貝數(shù),定量分析了7個(gè)T_1代陽性植株的目標(biāo)基因表達(dá),并對(duì)其籽粒大小進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明,利用Bar試紙條和目標(biāo)基因特異PCR檢測相結(jié)合的方法對(duì)21株轉(zhuǎn)基因T_0代再生苗進(jìn)行檢測,共鑒定出14個(gè)陽性植株,除2個(gè)植株的目標(biāo)基因拷貝數(shù)為3和1個(gè)植株為7外,其余11個(gè)T_0代轉(zhuǎn)基因植株目標(biāo)基因插入拷貝數(shù)均為1~2個(gè),其中有6個(gè)單拷貝植株。與野生型相比,7個(gè)T_1代陽性植株目標(biāo)基因表達(dá)量均極顯著增加,粒厚和粒寬均有不同程度增加,粒重極顯著增加。
【圖文】：

Ｔ０代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了Ｂａｒ試紙條檢測及多次重復(fù)ＰＣＲ檢測，圖２Ａ中Ｂａｒ試紙條檢測結(jié)果顯示，陰性對(duì)照（野生型ＪＷ１）和陰性轉(zhuǎn)基因植株只顯示一條控制線，而陽性轉(zhuǎn)基因植株則可同時(shí)顯出控制線和檢測線；圖２Ｂ中ＰＣＲ檢測檢測結(jié)果顯示，空白對(duì)照（ｄｄＨ２Ｏ）和陰性對(duì)照（野生型ＪＷ１）基因組均沒有擴(kuò)增出預(yù)期目的條帶，而陽性對(duì)照（ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１－ＴａＣＹＰ７８Ａ５質(zhì)粒）與陽性轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增出與理論值一致的１３５３ｂｐ目的條帶。從圖２中可以看出，Ｂａｒ試紙條檢測結(jié)果與ＰＣＲ檢測結(jié)果一致，２１株轉(zhuǎn)基因再生苗中共鑒定出１４株陽性植株。２．２Ｔ０代轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)入基因拷貝數(shù)以Ｔ０Ａ５－２１的基因組ＤＮＡ（５倍的稀釋，設(shè)置５個(gè)梯度）作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ，得到Ｐｉｎｂ和ＴａＣＹＰ７８Ａ５基因的擴(kuò)增曲線，并以模板濃度（Ｃ）的Ｌｏｇ值和對(duì)應(yīng)的Ｃｔ值為Ｘ軸和Ｙ軸，得到Ｐｉｎｂ和ＴａＣＹＰ７８Ａ５基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖３）。２個(gè)基因的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都為０．９９８，接近于１，所以得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于測定Ｔ０代轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)基因拷貝數(shù)。分別以各轉(zhuǎn)基因陽性植株的基因組ＤＮＡ為模板，用內(nèi)參基因Ｐｉｎｂ和ＴａＣＹＰ７８Ａ５基因特異引物和探針進(jìn)行ＴａｑＭａｎ實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ擴(kuò)增，每個(gè)待測樣品設(shè)定３個(gè)重復(fù)，得到其Ｃｔ值（表２），參照劉振華等［１４］和Ｗｅｎｇ等［１５］的方法進(jìn)一步計(jì)算各轉(zhuǎn)基因陽性植株中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)（表２）。農(nóng)桿

圖３內(nèi)參基因Ｐｉｎｂ（Ａ）和目標(biāo)基因ＴａＣＹＰ７８Ａ５（Ｂ）的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Ｆｉｇ．３ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｓｏｆｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｅＰｉｎｂ（Ａ）ａｎｄｅｘｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅＴａＣＹＰ７８Ａ５（Ｂ）表２轉(zhuǎn)基因植株目標(biāo)基因ＴａＣＹＰ７８Ａ５的拷貝數(shù)Ｔａｂｌｅ２ＣｏｐｙｎｕｍｂｅｒｏｆＴａＣＹＰ７８Ａ５ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ轉(zhuǎn)基因植株ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔＣｔ（Ｐｉｎｂ）Ｃｔ（ＴａＣＹＰ７８Ａ５）Ｘ拷貝數(shù)估測值ＥｓｔｉｍａｔｅｄｃｏｐｉｅｓＴ０Ａ５－１２７．２２±０．０４０３０．１６±０．００５０．１４１Ｔ０Ａ５－２２６．５６±０．０５０２７．４８±０．０３００．７３１Ｔ０Ａ５－３２５．１３±０．０２５２４．６７±０．０３０２．６８３Ｔ０Ａ５－４２７．６４±０．０１０２７．７６±０．０１０１．１８２Ｔ０Ａ５－６２５．１１±０．０３０２５．１１±０．１１０１．８７２Ｔ０Ａ５－１０２５．８３±０．０１５２４．１０±０．１６５６．５８７Ｔ０Ａ５－１３２５．４９±０．０８０２６．４４±０．０５００．８４１Ｔ０Ａ５－１５２５．３５±０．０２０２６．４９±０．０１５０．７６１Ｔ０Ａ５－１６２６．３３±０．０１０２６．２９±０．０１０１．６１２Ｔ０Ａ５－１８２６．３１±０．０１５２７．３８±０．０７５０．６７１Ｔ０Ａ５－１９２５．０９±０．０３５２４．９６±０．０３５２．０８３Ｔ０Ａ５－２１２６．０２±０．０２５２６．０１±０．１００１．６５２Ｔ０Ａ５－２２２８．７２±０．０２０２８．２８±０．０２５１．５６２Ｔ０Ａ５－２４２８．２６±０．０

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本文編號(hào)：2737085