【摘要】：黃花蒿(Artemisia annua L.)是菊科(Asteraceae)蒿屬(Artemisia)一年生草本植物,主治惡瘡、瘧疾和寒癥等各種發(fā)熱癥。青蒿素是其主要抗瘧成分,在黃花蒿腺毛中合成。由于青蒿素化學(xué)合成工藝復(fù)雜不能用于商業(yè)生產(chǎn),野生黃花蒿資源日益匱乏且青蒿素含量偏低,青蒿素的生物合成研究受到了研究工作者的廣泛重視。WD40轉(zhuǎn)錄因子基因與植物葉片表面腺毛發(fā)育、次生代謝相關(guān)。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate Reductoisomerase,DXR)是青蒿素合成中的關(guān)鍵限速酶。對黃花蒿轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵酶的研究,對了解青蒿素的的生物合成及其調(diào)控具有重要的理論意義。本研究利用RACE技術(shù)克隆出了AaWD40基因;并利用RNAi探討了DXR基因與黃花蒿生長發(fā)育及青蒿素合成的關(guān)系。研究工作主要包括以下三方面:本研究利用RACE技術(shù)從黃花蒿中克隆出AaWD40基因,并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。AaWD40基因的cDNA全長1 498 bp,其中5'末端非翻譯區(qū)為209 bp,3'末端非翻譯區(qū)為183 bp。開放閱讀框(ORF)的長度為1 106 bp,編碼368個氨基酸殘基,DNAMAN分析預(yù)測其等電點為4.64,分子量為41.29 kDa。對AaWD40氨基酸序列進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)其與多種植物具有較高的同源性。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AaWD40氨基酸序列含有4個典型的WD40重復(fù)區(qū)域,符合WD40基因的特征,所以命名為AaWD40。利用Swiss-Model對AaWD40蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)分析,AaWD40蛋白空間結(jié)構(gòu)錯綜復(fù)雜,與多種植物WD40空間結(jié)構(gòu)域非常相似。系統(tǒng)發(fā)育樹分析AaWD40與其他WD40均源于同一祖先,并且AaWD40與DpWDR、GhTTG4的親緣關(guān)系最為接近。利用Gateway克隆的技術(shù)構(gòu)建了DXR-RNAi載體,我們根據(jù)BLAST的結(jié)果選取了一段523 bp的干擾片段。通過BP反應(yīng),成功地把目的基因?qū)氲饺腴T載體pDONR221,并通過LR反應(yīng)構(gòu)建了目的載體pSGRNAi-DXR,即本實驗所需要的RNAi載體。我們應(yīng)用PCR鑒定、酶切鑒定、測序的方法,確認(rèn)了載體的成功構(gòu)建。同時,我們運(yùn)用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404,PCR鑒定結(jié)果顯示目的載體成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌。根據(jù)以上實驗基礎(chǔ),我們利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法成功地誘導(dǎo)出了轉(zhuǎn)基因黃花蒿,經(jīng)過kan抗性篩選共獲得36株抗性轉(zhuǎn)基因黃花蒿,并將其和野生型黃花蒿一起煉苗。為后續(xù)研究黃花蒿DXR基因功能奠定了基礎(chǔ)。利用PCR反應(yīng)對36株kan抗性植株進(jìn)行檢測,其中有5株獲得目的條帶,并以黃花蒿Actin為內(nèi)參,用黃花蒿DXR基因的特異引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株DXR的表達(dá)量比野生型植株顯著下調(diào)(平均下調(diào)了68%),RNAi顯著地影響了黃花蒿內(nèi)源DXR基因的表達(dá)。觀察發(fā)現(xiàn)DXR-RNAi后,轉(zhuǎn)基因黃花蒿的根和莖明顯伸長;葉片面積明顯減小;腺毛密度明顯下降,腺毛大小顯著增加。HPLC檢測結(jié)果表明,DXR-RNAi后青蒿酸和青蒿素含量顯著下調(diào),平均減少了39%和58%。研究結(jié)果初步證明了DXR基因在黃花蒿根、莖、葉生長和腺毛發(fā)育中發(fā)揮重要作用,DXR基因能夠調(diào)控青蒿酸和青蒿素的生物合成。通過本研究,我們首次從黃花蒿中克隆出AaWD40基因,并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,為進(jìn)一步研究AaWD40與黃花蒿生長發(fā)育,尤其是與黃花蒿腺毛發(fā)育的潛在關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。同時本研究利用RNAi技術(shù),分析了DXR基因在黃花蒿生長及青蒿素代謝中的重要調(diào)控功能,發(fā)現(xiàn)其影響黃花蒿生長、腺毛發(fā)育及青蒿素生物合成。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S567.219;Q943.2

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本文編號：2734593