發(fā)布時(shí)間：2020-06-29 20:41

【摘要】：目的:制備出能運(yùn)載YCD/Cx26雙質(zhì)粒的納米陽(yáng)離子微泡;分析載雙質(zhì)粒的納米陽(yáng)離子微泡結(jié)合超聲輻照進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的有效性;探索上調(diào)膀胱癌細(xì)胞的縫隙連接蛋白connexin26(Cx26)表達(dá),能否增強(qiáng)自殺基因系統(tǒng)YCD/5-FC(yeast cytosine deaminase/5-fluorocytosine)的旁觀者效應(yīng),從而提高消滅腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)。方法:運(yùn)用薄膜水化、物理機(jī)械震蕩法制備納米陽(yáng)離子微泡,利用靜電吸附原理及絡(luò)合效應(yīng)攜載質(zhì)粒。運(yùn)用納米陽(yáng)離子微泡結(jié)合超聲輻照轉(zhuǎn)染人膀胱癌T24細(xì)胞,電子熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀觀測(cè)轉(zhuǎn)染效率;RT-PCR及Western blot檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的mRNA與蛋白的相對(duì)表達(dá)量。CCK-8法比較在5-FC前藥誘導(dǎo)下攜載不同基因質(zhì)粒的納泡轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞存活率影響;流式細(xì)胞儀觀測(cè)Connexin26表達(dá)后對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡影響。結(jié)果:制備出穩(wěn)定性較好的納米陽(yáng)離子微泡(CMB),其平均粒徑(472.5±48.57)nm,平均表面電位為+(28.32±2.78)mv。CMB最大基因結(jié)合量和結(jié)合率分別為4μg/10~8個(gè)微泡和66.7%。一定超聲輻照條件下,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率為(30.28±2.04)%。RT-PCR、Western blot均證實(shí)納米陽(yáng)離子微泡結(jié)合超聲輻照這一基因遞送新方式,能成功將目的基因轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并高效表達(dá)。當(dāng)質(zhì)粒YCD:Cx26量比為5:5轉(zhuǎn)染,前藥5-FC(300μmol/L)誘導(dǎo)24h后:T24細(xì)胞存活率為(42.3±4.6)%;Cx26表達(dá)后,載YCD-Cx26納米陽(yáng)離子微泡組的細(xì)胞凋亡率為(60.68±2.61)%,明顯高于單載YCD基因納米陽(yáng)離子微泡組的(46.42±2.13)%,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義(P0.01)。結(jié)論:CMB可提高質(zhì)粒運(yùn)載能力,結(jié)合超聲輻照有效提高轉(zhuǎn)染效率并使目的基因成功表達(dá)。Connexin26表達(dá)后,直接改善細(xì)胞間通訊連接,增強(qiáng)自殺基因系統(tǒng)YCD/5-FC的旁觀者效應(yīng),促使腫瘤細(xì)胞凋亡,提高殺傷膀胱癌T24細(xì)胞的效率。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.14
【圖文】：

輕微混合均勻后，避光條件下常溫反應(yīng) 15min 后送流式上機(jī)檢測(cè)計(jì)學(xué)分析用 SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。滿足方差齊性及正態(tài)分布的組間相比較則采用單因素方差分析法，兩組間比較可采用 t 檢驗(yàn)；秩和檢驗(yàn)。以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組質(zhì)粒的鑒定過(guò)雙酶切的質(zhì)粒 DNA 電泳后會(huì)呈現(xiàn)兩條高亮條帶，一條為重組質(zhì)粒一條為目的基因片段，說(shuō)明酶切位點(diǎn)正確；而未經(jīng)過(guò)酶切的質(zhì)粒 DN超螺旋、線性、開(kāi)環(huán)三條或以上的高亮條帶�；驕y(cè)序結(jié)果與 Gen序列相比對(duì),序列完全正確, 無(wú)任何堿基突變，己成功擴(kuò)增了 YCD A 序列（圖 1）。

YCD-pcDNA-EGFP 質(zhì)粒

【參考文獻(xiàn)】

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1 張麗;劉瑩瑩;項(xiàng)光亞;呂清;黃桂;楊亞莉;張艷容;宋越;周歡;謝明星;;Ultrasound-triggered Microbubble Destruction in Combination with Cationic Lipid Microbubbles Enhances Gene Delivery[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2011年01期

本文編號(hào)：2734333