【摘要】：魁蚶是一種富含蛋白質(zhì)和維生素B12的海洋軟體動物,肉質(zhì)鮮美,具有良好的市場前景和經(jīng)濟價值。前期研究發(fā)現(xiàn),魁蚶具有較強的抗逆境能力,而且血細胞中具有紅細胞,這是有別于其他多數(shù)貝類的重要特征之一。血紅蛋白是紅細胞的重要成分,然而,目前有關(guān)魁蚶血紅蛋白的研究非常有限。為進一步明確魁蚶血紅蛋白的基因結(jié)構(gòu)及功能作用,本文對比了魁蚶、櫛孔扇貝和四角蛤蜊在低氧脅迫后的生存狀態(tài);克隆了3種魁蚶血紅蛋白基因并對其表達特性進行了研究分析;通過體外表達,得到了2種魁蚶血紅蛋白的重組蛋白,研究了其酶活特性。本研究豐富了貝類血紅蛋白的研究資料,為魁蚶抗逆機制等方面的研究提供了參考。溶氧是影響水生動物存活、生長和能量代謝等重要的環(huán)境因子之一,自然水體中經(jīng)常會出現(xiàn)周期性低氧和連續(xù)性的低氧現(xiàn)象。貝類在受到低氧脅迫后,會產(chǎn)生許多的應(yīng)對機制,不同貝類耐低氧能力存在很大的差別。本文通過對魁蚶(Scapharca broughtonii)、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)和四角蛤蜊(Mactra veneriformis)在4.5 mg/L、2.5 mg/L和0.5 mg/L溶氧量下的生存狀態(tài)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)的研究發(fā)現(xiàn),在相同溶氧濃度情況下,魁蚶的存活率高于櫛孔扇貝和四角蛤蜊,且在2.5 mg/L和0.5 mg/L組中從1天后開始呈極顯著差異(p0.01);魁蚶的半致死濃度比櫛孔扇貝和四角蛤蜊低,在3天時,魁蚶的LC50僅為1.97,而櫛孔扇貝和四角蛤蜊的分別為4.46和4.09;鰓、外套膜和血液中SOD酶活性和T-AOC雖有不同程度的變化,但隨著脅迫時間的延長,至72 h時魁蚶組基本能恢復(fù)到對照組水平,而櫛孔扇貝和四角蛤蜊低于對照組,且櫛孔扇貝組呈極顯著差異(p0.01)。本研究發(fā)現(xiàn)魁蚶有著比櫛孔扇貝和四角蛤蜊更強的低氧耐受能力。血紅蛋白在高等動物中分布廣泛,具有運載氧氣和維持滲透壓等多種重要功能。軟體動物中血紅蛋白的相關(guān)研究較少,有關(guān)血紅蛋白基因免疫功能的研究越來越受到關(guān)注。本研究以從魁蚶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得的部分序列為基礎(chǔ),通過c DNA末端快速擴增(rapid amplification of c DNA ends,RACE)技術(shù)克隆獲得了三種魁蚶血紅蛋白基因c DNA全長序列(命名為Sb Hb IIA、Sb Hb IIB和Sb Hb IIC),并進行了不同條件下m RNA表達研究。序列和結(jié)構(gòu)分析表明,Sb Hb IIA基因c DNA全長為867 bp,其中包括長度為483 bp的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF),編碼160個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量為17.5 k Da,理論等電點為9.68;Sb Hb IIB基因全長946 bp,包含459 bp的ORF,ORF編碼152個氨基酸殘基,預(yù)測蛋白分子量為17.1 k Da,理論等電點為5.10;Sb Hb III C基因c DNA全長為916 bp,包括447bp的ORF,編碼148個氨基酸殘基,預(yù)測蛋白分子量為15.8 k Da,理論等電點為7.944。氨基酸序列具有多個血紅素結(jié)合位點,具有血紅蛋白的特征序列,與毛蚶和泥蚶等近緣物種的血紅蛋白序列具有較高相似度,達80%以上,系統(tǒng)進化樹中也先與蚶科貝類血紅蛋白聚為一支。實時熒光定量PCR(q RT-PCR)結(jié)果表明,3種血紅蛋白基因變化趨勢具有較高的一致性。在魁蚶成體的斧足、鰓、外套膜、閉殼肌、血淋巴、肝胰腺,以及受精卵至發(fā)育23天的幼蟲體內(nèi)均能檢測到轉(zhuǎn)錄本;且在成體血淋巴中表達量最高,與其他5個組織表達量存在極顯著差異(p0.01);在受精卵至23d幼蟲期的表達變化中,Sb Hb IIA、Sb Hb IIB和Sb Hb IIC都是從發(fā)育的第12天時表達量開始急劇上升(p0.01),達到最低值的200倍以上;低氧脅迫后血淋巴中基因表達量呈先上升后下降的趨勢,4.5 mg/L、2.5 mg/L和0.5 mg/L處理組都是在16 h達到最高值,Sb Hb IIA、Sb Hb IIB和Sb Hb IIC的表達量都達到了對照組的4倍以上;鰻弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后,3種血紅蛋白基因的表達均呈先上升后下降的趨勢,但表達量最高值存在差異,Sb Hb IIA和Sb Hb IIB的表達高峰出現(xiàn)在16 h,而Sb Hb IIC的表達高峰出現(xiàn)在32 h,結(jié)果證明魁蚶血紅蛋白在應(yīng)對低氧脅迫和鰻弧菌侵染反應(yīng)過程中發(fā)揮了極其重要的作用,屬于一種免疫因子。利用體外重組表達技術(shù)獲得Sb Hb IIB和Sb Hb IIC基因的重組蛋白(命名為r Sb Hb IIB和r Sb Hb IIC),通過與L-DOPA底物反應(yīng),證明了其具有類酚氧化酶活性(phenoloxidase-like activity,PO-like activity)。r Sb Hb IIB蛋白PO-like活性最適PH和溫度分別為5.0和30℃,而r Sb Hb IIC的最適p H和溫度為7.4和40℃。多種氧化酶抑制劑(抗壞血酸、硫脲、檸檬酸等)和金屬螯合物(EDTA)對重組蛋白PO-like活性有著顯著的影響。金屬離子(Fe2+、Zn2+、Cu2+等)對其酶活影響差別較大,Mg2+和Ca2+對PO-like酶活性基本沒有影響,Cu2+等會顯著抑制其酶活性,但Fe2+對其酶活有著促進作用。通過實驗也驗證了Fe2+能恢復(fù)EDTA預(yù)處理過的重組蛋白的PO-like活性。抑菌實驗表明,r Sb Hb IIB和r Sb Hb IIC能夠明顯抑制鰻弧菌的生長。本研究從m RNA和蛋白水平均驗證了魁蚶血紅蛋白具有抑菌功能,為魁蚶后續(xù)免疫功能相關(guān)方面的研究提供了基礎(chǔ)資料。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

時 4.5 mg/L 組比對照組升高，其他組的酶活性基本恢復(fù)到對照組水平，而四角蛤蜊酶活性也有明顯下降，至 72h 時明顯低于對照組。櫛孔扇貝 24h 時只有 4.5mg/L 組有明顯升高，其他組均有降低，且 24 h 后的各時間點 4.5 mg/L、2.5 mg/L和 0.5 mg/L 組的酶活性低于對照組（p<0.01）。低氧脅迫后外套膜中 SOD 酶活變化情況見圖 1-2�？馈笨咨蓉惡退慕歉蝌鄱际窃诘脱跆幚砗� 24 h 的 4.5 mg/L 組出現(xiàn)酶活性最高值，同一時間段隨著溶氧濃度的降低，SOD 酶的活力明顯出現(xiàn)下降�？篮蜋笨咨蓉愒谕蝗苎跛浇M隨著處理時間的延長，其酶活性比對照組都有著明顯的降低。四角蛤蜊組在處理 48 h 后除 4.5 mg/L 組的高于對照組，其他組基本恢復(fù)到對照組水平�？�、櫛孔扇貝和四角蛤蜊血液中SOD酶的活力變化見圖1-3。3種貝類SOD酶活力在 4.5 mg/L 組脅迫 24 h 和 48 h 后明顯高于對照組，且隨著溶氧水平的降低，其 SOD 酶活性降低明顯，櫛孔扇貝組在 24 h 的 2.5 mg/L 組就明顯低于對照組，魁蚶是在處理 48 h 后的 2.5 mg/L 組開始低于對照組。四角蛤蜊在處理 48 h后除 4.5 mg/L 組外其他組 SOD 酶活力基本回復(fù)到對照組水平。

其 SOD 酶活性降低明顯，櫛孔扇貝組在 24 h 的 2.5 mg/L 組就明顯低于對照組，魁蚶是在處理 48 h 后的 2.5 mg/L 組開始低于對照組。四角蛤蜊在處理 48 h后除 4.5 mg/L 組外其他組 SOD 酶活力基本回復(fù)到對照組水平。圖 1-1 溶氧對魁蚶（A）、櫛孔扇貝（B）和四角蛤蜊（C）鰓中 SOD 酶活力的影響Fig 1-1 Effect of DO on activities of SOD in the gills of Scapharca broughtonii (A), ChlamysFarreri (B) and Mactra veneriformis (C).不同小寫字母間表示差異顯著（p<0.05），不同大寫字母間表示差異極顯著（p<0.01）。Different lowercase letters indicate significant difference (p<0.05), Different capital lettersindicate highly significant difference (p<0.01).

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本文編號：2734290